论文部分内容阅读
α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是一种包含有140个氨基酸的小分子酸性蛋白质。α-Syn普遍存在于脑部神经元内。α-Syn基因的缺失或突变,会引起多种神经疾病,特别是诱发常染色体显性遗传性帕金森病。然而,α-Syn突变体诱发帕金森病的确切机制在很大程上仍未有明确定论。蛋白质翻译后修饰与神经退行性疾病的关系是近年来的研究热点,尤其是对蛋白质的苏素化(SUMOylation)、泛素化(Ubiquitination)以及磷酸化(phosphorylation)的研究。但α-Syn的苏素化、泛素化与α-Syn降解过程的研究报道较少。因此,这项研究中,我们主要探讨苏素(Small ubiquitin-related modifier protein,SUMO)和泛素(Ubiquitin)在α-Syn降解途径中的作用,揭示SUMO和Ubiquitin对α-Syn的降解通路转换的影响。研究结果将丰富帕金森病发病过程中蛋白质降解的机理。本实验首先用两步法PCR技术构建带有Flag标签的野生型和突变型Ubiquitin真核表达质粒,即Flag-Ubiquitin WT、K29A、K48A、K63A以及双突变型G75AG76A。通过双酶切和基因测序确定序列的正确性;通过Western Blot方法确定重组质粒在细胞上的表达;通过免疫荧光标记技术了解野生型和突变型Flag-Ubiquitin在细胞内分布特征;通过LDH和WST-1的检测分析野生型和突变型Flag-Ubiquitin的细胞毒性。发现野生型和突变型Flag-Ubiquitin多分布于细胞胞浆,但在细胞核内也有少量分布。突变型FlagUbiquitin均有不同程度的细胞毒性,其中Flag-Ubiquitin G75AG76A的毒性最大。其次,B103细胞分别瞬时转染α-Syn WT和A53T质粒,然后用浓度为200μg/m L的Hygromycin B建立具有抗性筛选的稳定表达α-Syn WT、A53T的两种B103细胞株。最后,在稳定表达α-Syn WT和A53T的B103细胞株上,分别瞬时转染重组质粒Flag-Ubiquitin,通过免疫荧光标记分别检测α-Syn与SUMO、Ubiquitin以及与26S蛋白酶体定位结合情况。结果发现在B103细胞内,Ubiquitin与SUMO无明显共定位现象,而在稳定转染α-Syn的细胞内,却发现α-Syn与Ubiquitin、SUMO和26S蛋白酶体以及Ubiquitin与SUMO均有明显的共定位现象,修饰的α-Syn一部分由泛素介导的蛋白酶体系统降解。总之,突变型Flag-Ubiquitin产生的细胞毒性不同,这与它们在细胞内的分布特征以及形成的聚集体有很大关系。α-Syn能同时与Ubiquitin和SUMO结合,被泛素和SUMO修饰,形成α-Syn的泛素复合物以及α-Syn的SUMO复合物,并且在Ubiquitin与SUMO两者之间,可能存在着某种机制能够使Ubiquitin与SUMO相互作用共同修饰α-Syn,修饰的α-Syn一部分经由泛素介导的蛋白酶体系统降解。