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L-乳酸是食品工业、医药、化工等行业的重要有机酸原料,也是生产可生物降解塑料——聚L-乳酸的前体物质。聚L-乳酸以其良好的可生物降解性、优良的使用特性和原料的可再生性,被公认为取代传统塑料的理想材料之一。因此,提高L-乳酸的产量和旋光纯度,降低生产成本,成为近年来的研究热点。本实验室自主分离了一株能产高旋光纯度L-乳酸的菌株——Lb.paracaseiHD1.7株,并经前期研究对其进行了发酵条件优化和代谢流分析,初步分析了该菌株的产酸能力和代谢特点。若能进一步从酶活性水平分析该菌株的产酸代谢特征,加大L-乳酸生成的代谢通量,既可以进一步提高菌体的产酸能力,亦可以对L-乳酸发酵的代谢调控起到理论指导作用。本文以Lb.paracasei HD1.7产乳酸代谢途径相关酶为研究对象,通过营养因子、环境因子对磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙酮酸脱氢酶（PDH）、丙酮酸脱羧酶（PDC）和丙酮酸羧酶（PC）6种代谢相关酶活性的调控,分析了相关酶活性与L-乳酸发酵水平之间的关系,之后对产酸关键酶——乳酸脱氢酶的基因（包括1dhL和1dhD）进行了克隆与序列分析。研究结果表明:1、当葡萄糖浓度低于45g/L时,细胞密度高,菌体生长好,相关酶活性不高,L-乳酸产率较低。当葡萄糖浓度为60g/L到90g/L时,相关酶活性分别达到最高,但由于丙酮酸三条代谢支路酶PDH、PDC、PC活性的提高,L-乳酸产率没有达到最高;当葡萄糖浓度为105g/L时,L-乳酸的产率最高,达到80.2%,比15g/L时提高了24.1%。确定葡萄糖的最佳发酵浓度为105g/L。2、当蛋白胨浓度为5g/L时,相关酶的活性、细胞密度和L-乳酸的产率均最低。当蛋白胨浓度为15g/L时,相关酶的活性达到最高;当蛋白胨浓度为20g/L时,细胞密度最高;而当蛋白胨浓度为10g/L时,L-乳酸的产率最高,为81.3%,比5g/L时提高了15.5%。确定蛋白胨的最佳发酵浓度为10g/L。3、当培养基中MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O的浓度分别为0.15g/L、0.25g/L和0.40g/L时,对PFK、PK的激活作用最强;当浓度分别为0.20g/L、0.25g/L和0.40g/L时,对LDH的激活作用最强;但这两种条件下,PDH、PDC、PC的活性也大幅升高,不利于提高L-乳酸的产率。当浓度分别为0.10g/L、0.25g/L和0.40g/L时,细胞密度最高,L-乳酸的产率也最高,为81.9%,比浓度分别为0.10g/L、0.25g/L和0.20g/L时提高了21.9%。确定0.10g/L、0.25g/L和0.40g/L为MRS培养基的Mg2+、Zn2+、Mn2+的最佳配比浓度。4、培养基中添加0.075mg/L的维生素B1,对PFK、LDH的激活作用最强;4.0mg/L的维生素B3对PDC的激活作用最强;0.1mg/L的维生素B7,对PC的激活作用最强;0.075mg/L的维生素B7,对PK的激活作用最强,且此时细胞密度最高,L-乳酸的产率也最高,为84.5%,比对照提高了4.8%。确定在培养基中添加0.075mg/L的维生素B7最有利于L-乳酸的生成。5、当发酵液的pH控制在4.5～5.0时,细胞密度、相关酶活性、L-乳酸产量均最低;当pH控制为6.5～7.0时,细胞密度、各相关酶的活性最高;而当pH为5.5～6.0时,L-乳酸的产率最高,为81.2%。因此,确定Lb.paracasei HD1.7产L-乳酸发酵的最适pH为5.5～6.0。6、当培养温度为30℃时,相关酶的活性、细胞密度和L-乳酸产率都处于较低水平;而当培养温度升高到42℃,在发酵前12h对酶活性的激活作用较强,但到发酵后期却都有明显下降,L-乳酸产率也随之下降。当培养温度为37℃时,L-乳酸的产率最高,为81.6%。因此,确定Lb.paracasei HD1.7产L-乳酸发酵的最适温度为37℃。7、以Lb.paracasei HD1.7基因组DNA为模板,克隆获得981bp的1dhL序列和1002bp的1dhD序列。生物信息学分析表明,两序列与Lactobacillus casei BL23的1dhL和1dhD的核苷酸序列的相似性高达100%和99%;属于NAD依赖型脱氢酶家族;没有明显的亲水和疏水性;无信号肽;前者有明显的跨膜区,后者无跨膜区;二级结构分析,确定α-螺旋是该蛋白的整体结构的最主要结构元件。