口蹄疫是由口蹄疫病毒引起偶蹄兽猪、牛、羊等主要经济畜种发病的重大动物疫病。FMDV灭活疫苗作为FMD综合防控体系的重要组成部分,为有效防控和净化口蹄疫做出了十分重要的贡献,但灭活疫苗也存在诸多的缺点和不足,如需要区分疫苗免疫动物和自然感染动物,需要建设生物安全实验室;最为严重的是,病毒有逃逸生产车间的危险。分子生物学技术的发展以及合成肽免疫原性的证实,为研制FMDV抗原表位疫苗提供了理论依据和技术支持,人们对FMDV抗原表位疫苗进行了广泛的研究,在小动物模型显示出了良好的免疫效力,但是对本动物的免疫效果并不理想。近年来我国口蹄疫疫情有所抬头,出现A,O,Asia 1多个血清型交替流行的态势,严重地威胁我国畜牧业的健康发展,为了有效控制和净化在我国流行的FMDV,本研究针对我国目前流行的Asia 1型和O型FMDV毒株,利用分子生物学,蛋白质工程及其相关技术进行羊口蹄疫病毒Asia 1多表位疫苗和猪口蹄疫病毒O型多表位疫苗的研究,为我国有效防控FMD提供优质安全的疫苗储备。针对目前流行的Asia 1型江苏毒株,设计并合成了病毒主要抗原VP1的135-160肽段和197-211肽段的重复串联表位基因(RE)。采用RT-PCR技术克隆了羊的免疫球蛋白重链恒定区基因(OIgGC)和Asia 1病毒的3D基因,将3D、RE、OIgGC分别或融合插入pET-30a构建了一系列重组表达质粒pRE-OIgGC,p3D,pOIgGC,将RE插入pGEX-4T-1构建了pGST-RE重组表达质粒,并实现了这些重组蛋白在E.coli的规模化表达及高通量纯化,所有重组蛋白以包涵体形式表达。Western blotting结果显示,重组蛋白RE-OIgGC,3D和GST-RE能与FMDV阳性血清发生免疫反应,OIgGC能与兔抗羊血清发生免疫反应。将适量的重组抗原与等体积的ISA206佐剂混合制备一系列疫苗,即OIgGC(100μg/ml),RE-OIgGC(100μg/ml),RE-OIgGC(100μg/ml)+3D(50μg/ml)和GST-RE(100μg/ml)。通过免疫豚鼠和羊体,测定血清中和抗体效价、淋巴细胞增殖实验和攻毒保护实验对候选疫苗进行免疫效力评价。免疫豚鼠结果显示,除了PBS和OIgGC组外,重组蛋白RE-OIgGC,RE-OIgGC+3D和GST-RE均能诱导产生保护性中和抗体,加强免疫后能保护动物抵抗103 ID50口蹄疫病毒的攻击。添加FMD病毒3D的多表位疫苗组的中和抗体水平最高,与灭活疫苗诱导的中和抗体效价没有明显的不同。以GST和为载体蛋白的重组抗原免疫豚鼠后血清中和抗体并没有明显差异。另外,添加3D蛋白的疫苗组诱导了最高水平的淋巴细胞增殖,充分说明了3D蛋白具有改善体液免疫反应和诱发T细胞免疫反应的能力。羊免疫结果显示,以宿主自身分子IgG重链恒定区为载体蛋白的2组多表位疫苗的中和抗体水平明显高于以GST分子为载体蛋白组,加强免疫后血清中和抗体效价明显快速升高,说明OIgGC发挥了生物学功能,明显改善了多表位抗原的免疫原性,而3D蛋白的免疫佐剂功能不是特别明显。设计并合成了FMD病毒O型主要抗原VP1的140-160肽段和200-213肽段的重复串联表位基因(RE)。利用RT-PCR扩增了猪的免疫球蛋白重链恒定区基因(SIgGC)和O型病毒的3D基因,将3D、RE、SIgGC分别或融合插入pET-22b成功构建了重组表达质粒pRE-SIgGC和p3D,并实现了RE-SIgGC和3D重组蛋白在E.coli的规模化表达及高通量纯化,以包涵体形式表达的重组蛋白经Western blotting证实具有免疫反应性。RE-SIgGC和3D重组蛋白经纯化后按照适当比例进行混合,并与与氢氧化铝、完全弗氏佐剂和ISA206等多种佐剂配伍成10种不同形式的猪口蹄疫病毒O型多表位疫苗,通过本动物猪免疫效力试验筛获了一种候选疫苗,单剂免疫猪体后免疫效力达到甚至优于传统灭活疫苗。随后用试制的三批疫苗进行了候选疫苗的最小免疫剂量、免疫效力(PD50)、保存期和免疫持续期以及抗体消长情况测定,全面评价疫苗的免疫效力。结果显示,用抗原含量为83μg的疫苗免疫猪,不仅能诱发机体产生高滴度的保护性中和抗体,而且能保护猪只抵抗103 ID50口蹄疫病毒感染,5/5保护;三批候选疫苗的PD50为5.20~10.05达到甚至高于国家标准(3.0 PD50);免疫动物后30天,血清中和抗体达到峰值,此后,随时间的延长中和抗体效价开始下降,免疫后7个月内血清中和抗体水平仍然维持在较高水平,大多数(70%)免疫动物能够抵抗病毒的感染;疫苗于2~8℃保存12个月并不影响疫苗的免疫效力。这些结果充分说明了本研究研制的猪口蹄疫病毒O型多表位疫苗是一种具有良好开发前景的疫苗,有望替代灭活疫苗用于我国口蹄疫病毒的防控。总之,通过本研究我们成功设计、构建了Asia 1和O型口蹄疫病毒的多表位疫苗的组装体系和表达体系,并实现了重组抗原的规模化原核表达和高通量纯化。通过引入具有重要免疫学功能的宿主自身分子IgG和具有佐剂功能的FMDV的3D蛋白,明显提高了多表位疫苗的免疫效力,并诱发了T细胞免疫反应。通过豚鼠和本动物羊和猪筛获了具有良好免疫效力的候选疫苗,尤其是筛获的猪口蹄疫病毒O型多表位候选疫苗不仅具有良好免疫效力,而且抗原用量少、免疫持续期长,疫苗在2~8℃保存稳定,是一种十分具有开发前景的疫苗,对其他动物病毒抗原表位疫苗的研制具有借鉴意义。