【摘 要】
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可变剪接是广泛存在于真核生物中的现象,在提高蛋白功能多样性并调节基因表达及多种生理功能中均具有重要作用。唐氏综合征细胞粘附分子（Dscam）,最初因其在连接神经元方面的重要作用而被熟知,之后的大量研究发现其可以作为病原体特异性识别分子参与了节肢动物免疫反应,在抗菌肽表达、细胞吞噬及血细胞增殖等过程中具有重要的调控作用。Dscam可产生几万种至几十万种可变剪接异构体,且该现象仅存在于节肢动物中,是可
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可变剪接是广泛存在于真核生物中的现象,在提高蛋白功能多样性并调节基因表达及多种生理功能中均具有重要作用。唐氏综合征细胞粘附分子（Dscam）,最初因其在连接神经元方面的重要作用而被熟知,之后的大量研究发现其可以作为病原体特异性识别分子参与了节肢动物免疫反应,在抗菌肽表达、细胞吞噬及血细胞增殖等过程中具有重要的调控作用。Dscam可产生几万种至几十万种可变剪接异构体,且该现象仅存在于节肢动物中,是可变剪接的代表性基因。Dscam蛋白具有两种结构:跨膜型Dscam（m Dscam）和分泌型Dscam（s Dscam）。m Dscam的跨膜（TM）结构域可发生可变剪接产生两种跨膜变体,即Dscam[TM1]和Dscam[TM2]。目前对于这两种跨膜变体在免疫方面的差别尚不清楚,因此我们以中华绒螯蟹为研究对象,聚焦于m Dscam的跨膜结构域,对这两种跨膜变体的免疫功能分化进行了探究。在本研究中,我们首先从中华绒螯蟹基因组中获得并鉴定了Dscam[TM1]和Dscam[TM2],命名为Es Dscam[TM1]和Es Dscam[TM2],接着对这两种跨膜变体的跨膜结构域进行了疏水性分析和跨膜方式分析;多序列结果表明Es Dscam[TM1]和Es Dscam[TM2]的跨膜结构域高度保守。系统发育分析表明,Dscam[TM1]和Dscam[TM2]在进化上为独立的两支,然而只有1种TM的溞类m Dscam在进化上可与无脊椎动物Dscam[TM1]分为一支,这暗示着Dscam[TM1]和Dscam[TM2]可能存在非对称进化的现象。组织分布表达显示Es Dscam[TM1]和Es Dscam[TM2]在脑和免疫组织中高表达。在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染血细胞之后,Es Dscam[TM1]和Es Dscam[TM2]积极响应病原体的侵袭,在核酸水平上均表现出不同程度的上调,这表明Dscam的两种跨膜变体均参与了抗菌免疫反应。为了探究这两种跨膜变体是否对不同种细菌具有特异性表达,我们对中华绒螯蟹血细胞分别进行了副溶血弧菌（革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）刺激,通过针对血细胞的二代测序技术发现,两种细菌刺激后Dscam[TM1]的m RNA表达量均极显著高于Dscam[TM2],表明上述两种跨膜区变构体可能在抗菌免疫反应中具有差异化的功能。为进一步厘清其免疫功能,我们使用RNA干扰技术在中华绒螯蟹血细胞中分别敲降了含有TM1或TM2的跨膜型Dscam表达,结果发现上述基因敲降对抗菌肽表达的调控存在差异,Dscam[TM2]在此过程中表现出比Dscam[TM1]更为广泛和重要的作用。跨膜区的功能差异还可能与其所携带细胞内区段可变剪接外显子的不同有关,通过实时定量PCR技术发现Es Dscam[TM1]所携带的33号可变剪接外显子比例显著高于Es Dscam[TM2]。鉴于跨膜型Dscam细胞内区段第33号可变剪接外显子存在内吞基序的现象,我们使用免疫荧光及流式细胞术对含有TM1或TM2的跨膜型Dscam的吞噬调控能力进行了分析,结果发现Es Dscam[TM1]具有更强的血细胞吞噬调控功能。上述结果表明,中华绒螯蟹跨膜型Dscam跨膜区的两种功能域在该蟹血细胞抗菌免疫反应中具有差异化的功能,且可能与其所携带的细胞内区段可变剪接外显子有关。该研究在一定程度上填补了跨膜型Dscam跨膜区功能域的免疫功能研究缺失,为全面揭示跨膜型Dscam的免疫调控分子机制研究提供了重要依据。
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