脂肪沉积对猪的胴体品质与肉品质具有重要影响。研究表明,SCD1(硬脂酰辅酶A去饱和酶1)、LIPIN1(磷脂酸磷酸酶1)和DGAT2(二脂酰甘油酰基转移酶2)和是脂代谢的三个关键酶。SCD1在棕榈油酸和油酸的双键形成过程中发挥着重要作用,同时为甘油三脂的合成提供脂酰辅酶A。LIPIN1可为甘油三脂合成的最后一步提供二脂酰甘油,最终在DGAT2的催化作用下形成甘油三脂。同时,LIPIN1还是某些下游基因的转录辅活因子。本实验室的前期研究发现,瘦肉型猪和中国地方品种猪的脂肪沉积存在显著差异,而且上述三个基因在表达量上也存在明显的品种间差异。迄今,对这三个基因的研究主要集中在营养物质对表达水平的调控上,而对基因启动子的研究鲜有报道,上述三个基因的启动子序列尚不清楚,鉴于启动子对基因的表达具有重要的调控作用。为了深入揭示瘦肉型猪和中国地方品种猪之间脂肪沉积存在显著差异的分子机制,本试验克隆了长白猪和蓝塘猪SCD1、DGAT2和LIPIN1三个基因的启动子,并进行了品种间比较。在此基础上进一步构建了两类长白猪和蓝塘猪的LIPIN1启动子5’端序贯缺失的报告基因载体,分析了序列差异对LIPIN1基因转录活性的影响。研究结果如下:1.克隆了长白猪和蓝塘猪SCD1、DGAT2和LIPIN1三个基因的启动子,获得两个品种长约1700 bp的SCD1启动子序列、长约2100 bp的DGAT2启动子序列和长约2900 bp的LIPIN1启动子序列。比较了这三个启动子在两个品种间的序列差异:发现DGAT2的启动子序列非常保守,仅有2处单核苷酸突变和1处不同长度的poly A;SCD1启动子序列也较为保守,仅有8处单核苷酸突变和1处不同长度的poly A。2.通过生物信息学分析,发现两个品种猪在LIPIN1启动子的5’端保守区(约-2100~-1800 bp)的序列完全一致,并预测到一些与脂代谢相关的转录因子的结合位点。但是,在3’端的高GC区域(约-100~+305 bp),蓝塘猪的高GC片段比长白猪更长,并预测到一些核心转录因子的结合位点;在此外的其他区域,两个品种猪之间共存在24处单核苷酸突变和多处基序的插入、缺失和替换。3.为了证明高GC区是否为LIPIN1基因的核心启动子并揭示品种间的序列差异对LIPIN1基因转录活性的影响,本文构建了两类蓝塘猪和长白猪的LIPIN1启动子5’端序贯缺失的报告基因载体,其中一类包含3’端高GC区,另一类不含3’端高GC区。将上述载体分别转染3T3-L1和HepG2细胞系发现:在高GC区域存在的情况下,LIPIN1启动子活性随着5’端的逐渐完整而发生变化。在3T3-L1细胞系中是逐渐降低,而在HepG2细胞系中表现为先逐渐升高,在-1820~-1308 bp之间突然降低,而后继续升高。在这两种细胞系中,LIPIN1启动子-1308~-709 bp之间的活性为长白猪显著高于蓝塘猪。在高GC区域缺失的情况下,任何长度的LIPIN1启动子均不再表现出活性。对多个品种猪的LIPIN1启动子的3’端高GC区域进行琼脂糖凝胶电泳和测序,发现不同品种猪的该区域长度均不相同。综上所述,LIPIN1基因的启动子序列存在品种间差异,这种差异会影响基因的转录活性,可能是造成不同品种之间脂肪沉积差异的一个重要原因。