食品安全是人类和动物生命健康安全的重要保障，在发展中国家由于人口、环境、经济等因素的影响，食品安全问题更加严峻，主要表现为食品中致病微生物的污染，包括细菌、真菌和病毒，其中真菌中的霉菌因引起储存粮食霉变导致食物中毒和肿瘤而备受关注。随着社会的发展，人们对食品安全越来越重视，储存粮食中霉菌的检测也越来越追求准确、高效、快速，已从传统形态学方法逐渐向快速分子生物学方法转变，实时荧光核酸恒温扩增技术（Simultaneous Amplifi cation and TestingSAT）是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合，既避免了常规DNA检测中死亡微生物DNA造成的假阳性，也减少了程序设置的复杂性，应用前景广阔。本研究以霉菌几丁质合酶Ⅲ保守序列作为靶标序列，以黑曲霉菌为代表菌种，建立一种SAT检测黑曲霉菌的新方法，为食品中黑曲霉菌的检测提供一种方法学探索。
　　将黑曲霉菌标准菌株（ATCC16404）复苏后接种于沙氏琼脂培养基，置于30℃温箱培养，通过生长速度、菌落颜色等特征进行初步鉴定，然后通过CATB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）法从黑曲霉菌中提取DNA作为模板，利用真菌18S通用引物对黑曲霉菌进行PCR鉴定，并通过PCR（polymerase chain reaction）扩增产物测序进一步确认。
　　基于霉菌几丁质合酶Ⅲ保守序列设计引物，通过PCR从黑曲霉菌中扩增目的DNA，采用凝胶回收试剂盒从凝胶中回收目的DNA片段，经T4连接酶与质粒pGM-T连接，构建重组质粒“pGM-T-目的DNA”，转化导入Top10感受态细胞，接种于LB平板培养过夜进行初筛。挑选克隆菌落，采用针对pGM-T的通用引物T7、SP6，进行菌落PCR鉴定，并通过测序确定重组质粒连接方向正确。
　　将鉴定的克隆菌接种于LB液体培养基增菌培养，用质粒提取试剂盒从细菌中提取重组质粒“pGM-T目的DNA”，行1.5%琼脂糖凝胶电泳验证。然后Sal I酶切重组质粒使之呈线性，在转录酶T3P10作用下，37℃进行转录，转录产物RNA经甲醛变性胶电泳进行检测，其作为SAT反应体系的RNA模板。
　　基于霉菌几丁质合酶Ⅲ保守序列，利用DNAman和Beacon desi gner软件设计SAT检测体系的引物和探针，通过探针熔解曲线试验，确定探针符合SAT反应温度要求；转录RNA梯度稀释后作为模板加入SAT裂解体系，模拟样本裂解时释放RNA的过程；采用磁珠捕获法模拟样本中RNA的提取过程；通过进行SAT反应，以确定SAT检测体系的可行性。
　　对构建的SAT体系进行优化。通过固定SAT反应液、模板RNA浓度、探针浓度，改变上下游引物浓度，筛选出合适的引物浓度；再通过固定SAT反应液、模板RNA浓度、上下游引物浓度，改变探针浓度，筛选出合适的探针浓度。研究结果确定SAT体系最佳条件是上下游引物浓度为10pmol/μL，探针浓度为10pmol/μL。
　　对食品中常见致病菌，包括黑曲霉菌、白色念珠菌、沙门菌、志贺菌、大肠埃希菌O157:H7、铜绿假单胞菌、蜡样芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌，分别提取RNA，进行SAT检测，以评价SAT检测体系的特异性；从黑曲霉菌不同浓度孢子悬液中提取RNA，进行SAT检测，以评价反应体系的灵敏度，并采用Microsoft Excel进行线性相关性的统计学分析，对反应体系灵敏度检测的可行性进行分析。
　　通过以上实验研究，初步建立了黑曲霉菌检测的SAT检测体系，特异性达100%；灵敏度可达到103拷贝数/mL，经过进一步优化体系提高敏感性后，可成为食品中黑曲霉菌检测的新方法。