论文部分内容阅读
角质酶（cutinase, EC 3.1.1.74）既可以降解不溶性多聚体植物的角质,也可以催化水解各类短链或长链脂肪酸酯、乳化的甘油三酯以及各种天然或合成聚酯等,是一种多功能的水解酶。近来研究发现,角质酶能有效降解棉纤维表面的角质和改善合成纤维的表面性质,其研究开发对促进纺织工业的节能、降耗、减排,推动生态纺织业的发展具有积极意义。近30年来,国内外对真菌和细菌来源的角质酶都进行了广泛研究,但目前仍没有高活力、高催化效率、宽适用条件、稳定性强的纺织用角质酶工业化生产的成功实例。其原因主要是天然酶对聚分子纤维类底物的亲和力差、可及度偏低,从而使酶的作用效果大大降低。以往研究者大多采用定点突变的方法改造酶活性中心附近位阻大的氨基酸残基来提高酶的催化效率,但这种方法工作量大,见效慢,成功率较低。通过分析纺织棉纤维的表面结构发现,棉纤维表面除了含有角质、蜡质、果胶等杂质成分外,还富含大量的纤维素和半纤维素成分。因而除了定点突变的方法外,作为纺织用酶,可以利用纤维素结合域（cellulose-binding module, CBM）对纺织纤维分子的吸附特性,构建天然酶与结构域的融合蛋白应用于纺织纤维的生物处理中。本论文研究了Thermobifida fusca角质酶-纤维素结合域融合蛋白的构建及定性,探讨了该融合蛋白在纺织生物精练及纤维改性中的应用效果,并对其进行了分子改造。主要研究结果如下:（1）选择T. fusca的CBMCel6A和Cellulomonas fimi的CBMCenA作为构建融合蛋白的研究对象。通过重叠PCR技术,将这两个CBM基因分别融合到角质酶基因的C端。采用具有PelB信号肽和6-His纯化标签的pET20b（+）质粒作为表达载体,使角质酶-CBMCel6A和角质酶-CBMCenA两个融合基因在Escherichia coli BL21（DE3）中过量表达。采用Ni亲和柱对两种融合蛋白进行分离纯化,纯化后重组蛋白达到电泳纯且两种融合蛋白分子量相同大约为45kDa。角质酶-CBMCel6A和角质酶-CBMCenA的比活力分别为440 U/mg和337 U/mg。两种角质酶-CBM融合蛋白的最适反应温度均为50°C,在50°C的半衰期均为53 h;角质酶的最适反应温度为60°C,在50°C的半衰期为70 h。角质酶及其两种融合蛋白的最适pH均为8.0,pH稳定范围在6-9。两种角质酶-CBM融合蛋白和角质酶一样均能催化作用于可溶性酯（pNPB）、不溶性甘油三酯,还能有效水解角质。角质酶-CBMCel6A和角质酶-CBMCenA的Km与角质酶相似,催化效率(Kcat/Km)分别是角质酶的94%和85%。（2）考察了IPTG和乳糖诱导浓度对重组大肠杆菌产酶的影响,IPTG最适浓度为0.4-0.6 mmol/L,乳糖的最适浓度为2 g/L。考察了甘氨酸对重组大肠杆菌产酶的影响,在对数生长前期添加0.5%的甘氨酸,能促进重组蛋白的胞外分泌,使胞外酶活提高了1.5-1.6倍。研究了不同浓度表面活性剂对重组大肠杆菌产酶的影响,添加1%的Triton X-100对大肠杆菌生产重组酶有明显的促进作用,最终酶活提高了1.8-2.1倍;Tween 80和Tween 60对促进大肠杆菌产酶的效果不明显;JFC严重抑制菌体的生长及产酶量。3 L发酵罐上补料培养发酵周期比摇瓶发酵缩短一半,角质酶-CBMCel6A最高酶活为286 U/mL,角质酶-CBMCenA为234 U/mL,角质酶达506 U/mL,均比摇瓶发酵提高5倍左右,为实现工业化生产奠定基础。（3）对棉纤维的吸附结果表明,在不加入果胶酶时,角质酶-CBMCel6A和角质酶-CBMCenA对棉纤维的吸附效率比角质酶分别提高2%和28%;加入果胶酶后,角质酶-CBMCel6A和角质酶-CBMCenA对棉纤维的吸附效率比角质酶分别提高40%和45%。对棉纤维的水解产物分析表明,在不使用果胶酶时,角质酶-CBMCel6A和角质酶释放脂肪酸的量相当,角质酶-CBMCenA释放脂肪酸的量是角质酶的1.8倍;而与果胶酶复合使用时,两种融合蛋白释放脂肪酸的量均是角质酶的3倍。进一步通过GC/MS分析了酶处理对棉纤维表面角质的降解作用;FT-IR分析了酶处理前后棉纤维化学成分的变化;SEM观察了棉纤维表面形态结构的变化。结果表明,角质酶-CBM融合蛋白与果胶酶的协同效果,和碱精练一样,能有效去除棉纤维中的角质、果胶质和蜡质等非纤维素成分;并且角质酶-CBM融合蛋白与果胶酶复配下,极大地提高了棉织物的润湿性能和染色性能。（4）对醋酸纤维的吸附结果表明,角质酶-CBMCel6A和角质酶-CBMCenA对醋酸纤维的吸附效率比角质酶分别提高15%和16%。两种角质酶-CBM融合蛋白水解醋酸纤维生成的乙酸量相当,是角质酶的1.6倍,表明了细菌角质酶及其融合蛋白都具有乙酰酯酶的潜在特性。两种角质酶-CBM融合蛋白处理的醋酸纤维比角质酶有较强的润湿性（低吸水时间）,其润湿时间分别为:角质酶-CBMCel6A为18 min,角质酶-CBMCenA为16 min,角质酶为28 min,说明了融合蛋白比角质酶更大程度地改善了醋酸纤维的表面性质。Triton X-100能增强角质酶及其融合蛋白的作用效果,提高醋酸纤维的润湿性和染色性。角质酶对涤纶纤维表面改性结果表明,角质酶能水解涤纶纤维产生对苯二甲酸类物质,且能与Triton X-100联合作用明显改善涤纶的润湿性和染色性。（5）以C. fimi CBMCex结构域晶体结构（PDB代码1EXG）为模板,通过SWISS-MODEL软件模拟,得到C. fimi CBMCenA结构模型。模型显示,该家族CBM具有三个处于同一相对平坦平面上的高度保守的色氨酸残基。多重序列比对结果表明,其中第14位、第34位和第50位的色氨酸是高度保守的,而第68位色氨酸保守性相对较差。在结构模拟和理性分析的基础上,成功构建了七种角质酶-CBMCenA突变体。性质研究分析表明,这些突变体都具有良好的热稳定性和pH稳定性;突变体W68L和W68Y对涤纶纤维的吸附效率分别比天然酶提高14%和17%,水解涤纶纤维释放的产物量分别是天然酶的1.4倍和1.5倍;其余突变体对涤纶纤维的吸附及水解效率和天然酶无明显差别。