第一部分微管蛋白在颞叶癫癇模型突触后致密物中的动态表达目的:探讨微管蛋白α-tubulin与β-tubulin在颞叶癫癇大鼠模型突触后致密物(PSD)中的动态表达。方法:健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重250±20 g,200只,实验随机分为对照组和颞叶癫癇(TLE)组。建立氯化锂-匹罗卡品颞叶癫癇大鼠模型,分别在癫癇持续状态(SE)后1d、3d、7d、15d、30d 6个时间点提取全脑组织,分离PSD蛋白。应用westernblot方法检测β-actin、β-tubulin及GAPDH蛋白在PSD中的表达变化,确定PSD蛋白western blot半定量分析的内参;采用western blot及免疫电镜方法检测微管蛋白α-tubulin与β-tubulin在PSD中的表达变化。结果:1.氯化锂-匹罗卡品大鼠致癇模型:SE诱发成功率为91.1%,总死亡率为20.6%,模型成功率为70.6%。2.PSD蛋白纯度:NR1与PSD-95蛋白在P2成分、突触小体及PSD中均呈免疫印迹阳性,而SynPhy蛋白在PSD成分中呈阴性。3.颞叶癫癇大鼠PSD蛋白western blot半定量分析的内参确定:β-actin、β-tubulin及GAPDH在对照组中均表达,β-actin及β-tubulin蛋白含量从SE后1d开始减少,SE后7d降至最低,SE后15d、30d表达有所增多,但仍低于对照组(P<0.01)。而GAPDH蛋白在SE各组及对照组中的表达无明显差异(P>0.05)。随后,我们随机选取正常对照组及SE后15天PSD蛋白两个样本,每个样本置6个泳道,分别对这三个蛋白进行分析。实验证实与正常对照组的6个泳道蛋白相比,SE后15天6个泳道的蛋白β-actin与β-tubulin的表达均明显减少,有明显的统计学意义(P<0.01)。而GAPDH的表达在所有泳道中的表达则无明显差异(P>0.05),提示β-actin与β-tubulin的表达变化与加量误差无关。4.微管蛋白α-tubulin与β-tubulin在PSD的表达检测:①α-tubulin与β-tubulin在SE后1d、3d、7d、15d、30d的表达明显减少,SE后7d降至最低(P<0.01),在SE后15d及30d蛋白含量较SE后7d时有所增多,但仍明显低于对照组(P<0.01)。②免疫电镜结果显示在正常对照组海马CA1中,β-tubulin蛋白在突触前、突触问隙、突触后及胞浆中均有表达。与对照组比较,PSD中β-tubulin在SE后1d、3d、7d、15d、30d PSD中的阳性表达颗粒明显减少,SE后7d降至最低(P<0.01),几乎未见有阳性颗粒表达,SE后15d及30d表达颗粒有所增多,当仍明显低于对照组(P<0.01)。结论:1.GAPDH蛋白更适合做颞叶癫癇大鼠PSD蛋白westernblot半定量研究的内参。2.PSD蛋白tubulin参与了颞叶癫癇形成机制。第二部分突触后致密物微管蛋白对颞叶癫癇大鼠自发发作的影响目的:探讨突触后致密物微管蛋白α-tubulin与β-tubulin对颞叶癫癇大鼠反复自发发作形成的影响。方法:健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重250±20g,236只,实验随机分为对照组、TLE自发发作(TLE-SRS)组和TLE无自发发作(TLE-NSRS)组。建立氯化锂-匹罗卡品颞叶癫癇大鼠模型,提取全脑组织,分离PSD蛋白。采用western blot及免疫电镜方法检测微管蛋白α-tubulin与β-tubulin在PSD中的表达变化。结果:1.氯化锂-匹罗卡品致癇模型SE诱发成功率为91%,总死亡率为22%,模型成功率为72.5%,自发发作率为50.5%。TLE-SRS组大鼠EEG异常,表现θ节律增多及单个、多个棘波或阵发连续棘波群发放;TLE-NSRS组大鼠EEG表现为正常或轻度异常,有时可发现散在的棘波或尖波;生理盐水对照组EEG亦未见癫癇样放电波。2.尼氏染色:与对照组比较,TLE-SRS组海马CA1、CA3区及齿状回区均有显著的神经元减少(P<0.01)。CA1区和CA3区锥体细胞层神经元排列紊乱,可见部分神经元形态不完整,细胞肿胀或皱缩、轮廓模糊、界限不清,细胞间距加大,胞浆尼氏小体减少。齿状回颗粒细胞边界不整齐、排列松散、增宽,呈现颗粒细胞发散改变。TLE-NSRS组存活神经元与对照组相比也有明显减少,但较SRS组要多(P<0.01)。3.微管蛋白α-tubulin与β-tubulin在PSD的表达检测:①与对照组比较,TLE-NSRS组α-tubulin在PSD中表达明显减少(p<0.01),TLE-SRS组PSD中α-tubulin含量较对照组也显著减少(p<0.01);与NSRS组相比,其表达水平也明显降低(p<0.01)。②与对照组比较,TLE-NSRS组及SRS组β-tubulin在PSD中表达明显减少(p<0.01);与NSRS组相比,SRS组PSD中β-tubulin含量也明显降低(p<0.01)。免疫电镜结果显示在正常对照组海马CA1中,β-tubulin蛋白在突触前、突触间隙、突触后及胞浆中均有表达,我们将着重与突触后致密物PSD中β-tubulin在SE后的表达变化。与对照组比较,蛋白β-tubulin在TLE-NSRS组及SRS组PSD中的阳性表达颗粒明显减少(p<0.01),与NSRS组相比,SRS组PSD中β-tubulin含量也明显降低(p<0.01)。支持western blot分析结果。结论:PSD中Tubulin蛋白表达与颞叶癫癇反复自发发作呈负相关。第三部分海马微管稳定性对颞叶癫癇成的影响目的:探讨干预微管的稳定性对颞叶癫癇形成的影响。方法:①健康成年雄性SD大鼠,体重250±20g,75只,立体定向海马注射不同剂量的秋水仙碱(微管解聚剂)及紫杉醇(微管聚合剂),根据尼氏染色、免疫组织化学检测β-tubulin的表达确定秋水仙碱及紫杉醇的最佳注射剂量。②健康成年雄性SD大鼠,体重250±20g,60只,建立氯化锂-匹罗卡品颞叶癫癇大鼠模型,在SE后7天,分别予以立体定向海马注射最适剂量的秋水仙碱及紫杉醇,归于秋水仙碱干预组及紫杉醇干预组。对各组大鼠进行行为学观察及脑电图记录,30天后根据有无自发发作每组又分为自发发作组及无自发发作组两亚组。采用免疫电镜方法检查β-tubulin在PSD中的表达。结果:1.海马注射秋水仙碱最适剂量的确定:①尼氏染色:与对照组相比,秋水仙碱0.01、0.03、0.1、0.3ug干预组存活神经元数量无明显变化(p>0.05),1.0与2.0ug治疗组神经元死亡明显增多(p<0.01),细胞排列紊乱,可见神经元形态不完整,细胞肿胀或皱缩、轮廓模糊、界限不清。②免疫组织化学方法检测发现对照组可见β-tubulin大量表达,主要分布在胞浆,与对照组比较,秋水仙碱0.01、0.03、0.1ug治疗组β-tubulin表达无明显差异(p>0.05),0.3ug治疗组表达减少(p<O.01),1.0与2.0ug治疗组明显减少(p<0.01)。③提示海马注射秋水仙碱的最佳剂量为0.3ug,使微管解聚,但不影响神经元细胞的存活。2.海马注射紫杉醇最适剂量的确定:①尼氏染色:与对照组相比,紫杉醇0.1、0.5、1.0ug干预组存活神经元数量无明显变化(p>0.05),1.5ug治疗组神经元死亡明显增多(p<0.01),细胞排列紊乱,可见神经元形态不完整,细胞肿胀或皱缩、轮廓模糊、界限不清。②免疫组织化学方法检测发现与对照组比较,紫杉醇0.1、0.5ug治疗组β-tubulin表达无明显差异(p>0.05),1.0ug治疗组表达较对照组增多(p<0.05),但1.5ug治疗组表达明显减少(p<0.01)。③提示海马注射紫杉醇的最佳剂量为1.0ug,使微管聚合,但不影响神经元细胞的死亡。3.秋水仙碱0.3ug干预组及紫杉醇1.0ug干预组大鼠行为学及EEG与对照组无差异,提示秋水仙碱及紫杉醇无致癇性。4.TLE组白发发作率为75%,秋水仙碱组自发发作率为90%,。紫杉醇组自发发作率为40%。脑电图结果显示TLE-SRS组大鼠EEG重度异常,表现θ节律增多及单个、多个棘波或阵发连续棘波群发放,TLE-NSRS组大鼠EEG正常或轻度异常,偶见单个棘波或尖波发放,与TLE-SRS组比较,秋水仙碱-SRS组大鼠EEG无显著差异,而紫杉醇-SRS组大鼠EEG棘尖波明显减少,频率及波幅均降低。秋水仙碱-NSRS组及紫杉醇-NSRS组大鼠EEG与TLE-NSRS组相比无显著差异。5.微管蛋白β-tubulin在PSD的表达检测:免疫电镜结果显示与TLE-SRS组比较,秋水仙碱-SRS组β-tubulin表达无显著差异(p>0.05),而紫杉醇-SRS组表达明显增多(p<0.01)。秋水仙碱-NSRS组与紫杉醇-NSRS组与TLE-NSRS组比较β-tubulin表达无显著差异(p>0.05)。结论:1.海马微管稳定性障碍是颞叶癫癇形成的易感因素;2.促微管聚合剂可能可防止颞叶癫癇形成。