【摘 要】
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由新型冠状病毒（SARS-Co V-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）目前已成为全球性重大公共卫生事件。对SARS-Co V-2的快速检测,是控制疫情的有效手段。研究发现,SARS-Co V-2在光滑的物体表面可存活数小时,在食品冷链中等温度、湿度适应的特殊条件下,SARS-Co V-2可存活数天,可能导致感染的风险。目前,国内新冠疫情得到了有效的控制,但由于国外疫情不断恶化,大量进口
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由新型冠状病毒（SARS-Co V-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）目前已成为全球性重大公共卫生事件。对SARS-Co V-2的快速检测,是控制疫情的有效手段。研究发现,SARS-Co V-2在光滑的物体表面可存活数小时,在食品冷链中等温度、湿度适应的特殊条件下,SARS-Co V-2可存活数天,可能导致感染的风险。目前,国内新冠疫情得到了有效的控制,但由于国外疫情不断恶化,大量进口产品（尤其是食品冷链产品）多次检测到SARS-Co V-2。因此,对食品等需冷链运输的物品外包装进行快速高效检出SARS-Co V-2,是防控疫情的一个重要手段。目前,核酸检测仍是检测SARS-Co V-2的金标准,但由于无法实现就地、及时、便捷的检测,故以抗原为检测对象的免疫学检测方法能起很大的辅助作用。本实验选用了SARS-Co V-2中基因序列最保守的N蛋白作为免疫原,制备了SARS-Co V-2的N蛋白单克隆抗体,建立了酶联免疫ELISA和胶体金免疫层析试纸条两种免疫学检测方法,优化了两种方法的检测条件并评估了实验方法的性能,两种方法可用于食品表面SARS-Co V-2的检测。本文通过培养和诱导含SARS-Co V-2重组N蛋白基因序列的大肠杆菌BL21（DE3）菌株,使其表达重组N蛋白。以N蛋白作为免疫原免疫雌性Balb/c小鼠,得到了血清效价达5.12×10~5的小鼠。取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经筛选克隆得到了1F57A6G、2B39F2B两株单克隆抗体。选择效价更高的2B39F2B单克隆抗体建立后续实验方法。N蛋白间接竞争ELISA法,该方法的最优条件为:N蛋白包被量0.1μg/孔,单克隆抗体稀释倍数为2×10~6倍,选取0.5%脱脂乳粉作为封闭液,酶标二抗稀释2×10~5倍。在p H 7.4的环境下,该方法的灵敏度IC50为22.16±1.77μg/L,检测限IC15为0.31±0.75μg/L,并且具有较好的特异性。选择1.5μg/L浓度的N蛋白抗原作为标准品,加入终浓度为5、50、250、500μg/L的N蛋白,其回收率分别为95.96%-104.46%、98.62%-106.48%、97.84%-101.45%和99.40%-101.27%,标准偏差（SD值）低于5%。用柠檬酸三钠还原法成功制备了直径为17 nm的胶体金颗粒。将胶体金与2B39F2B单抗相连接,制备出金标抗体,并建立了针对N蛋白抗原的胶体金免疫层析试纸条方法。此方法的最优条件为:羊抗鼠二抗稀释20倍,N蛋白包被原稀释10倍,用Sartorious品牌NC95型号的NC膜,单抗添加量3μL,碳酸钾添加量为5μL,选p H 7.4的PBS作为上样缓冲液。该方法可视检测限为（v LOD）和检测限（LOD）分别为62μg/L和500μg/L,并具有良好的特异性、稳定性和重复性。对阴性样品进行加标回收实验,结果显示与市售试纸条的结果一致,故具有良好的准确性。试纸条法可在10 min左右得出结果,能作为早期筛查的重要手段。本研究所建立的两种新冠病毒抗原快速检测方法对SARS-Co V-2的早期检测、预防和控制具有良好的应用前景。
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