鸽痘病毒分离株鉴定、致弱及免疫效力研究

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鸽痘是由鸽痘病毒(Pigeonpox virus, PPV)引起的一种接触性的常发传染病。PPV为痘病毒科禽痘病毒属,是体积最大的一类DNA病毒。鸽痘通常分为皮肤型和黏膜型两种,前者以体表无羽毛部位出现散在的、结节状的增生性皮肤病灶;后者以上呼吸道、口腔和食管部黏膜出现纤维素性坏死和增生性病灶。从南京市及周边肉鸽饲养场疑似患鸽痘的皮肤中分离到两株病毒,命名为NJ-18和ZJ。通过对其进行病毒分离、负染透射电镜、包涵体检查、理化特性、血清特异性、4b核心蛋白序列和动物致病性各项指标测定。结果表明:电镜下病毒粒子椭圆形,具有囊膜,大小240330nm,表面呈桑椹样,为典型痘病毒科病毒结构特征;细胞浆中有包涵体,红色、圆形或椭圆形;两株病毒均对乙醚、氯仿、pH3.0、pH11.0均敏感、56℃30min病毒均丧失活力;血凝效价为1:16和1:32; NJ-18 EID50为10-6.67 /0.2mL,ZJ EID50为10-7.32/0.2mL;鸽痘血清对NJ-18和ZJ中和效价都为1:126,鸡痘血清对NJ-18和ZJ中和效价分别为1:4和1:8;4b核心蛋白核苷酸序列同源性比较中,NJ-18 4b核心蛋白序列与ZJ同源性为93.4%,与India株同源性最高为99.6%,与CVL950株同源性最低为71.5%。NJ-18、ZJ 4b核心蛋白序列与已公开发表的其他禽痘病毒4b核心蛋白比较发现:NJ-18与FPV Diftosec CT同源性最高为90.9%,与CPV V同源性最低为66.8%。ZJ与FPV Diftosec CT同源性最高为90.9%,与CPVGB724-01-02同源性最低为66.9%。两株病毒都能引起1月龄鸽全身性痘疹,雏鸡致局部轻微痘疹,对金丝雀完全没有致病性;攻毒用毒株ZJ最小发痘量为50 EID50。以上结果综合证明两株病毒为鸽痘病毒。采用鸡胚连续传代方法,使PPVNJ-18分离株致弱,获得了一株具有良好免疫原性、安全且纯净的鸽痘弱毒株,命名为PPVNJ-18F1-E1。结果表明:PPVNJ-18经过连传16代,CAM出现水肿和痘斑典型的鸽痘病变,且对1月龄鸽丧失致病性,说明毒力减弱;在F16代的基础上连续传E16代,鸡胚绒毛尿囊膜病变和EID50均稳定; E1、E5、E10和E16代病毒,经鸽体传5代,其毒力稳定,不返强;E1、E5、E10和E16代病毒接种鸽后,均于接种部位出现轻微痘肿,为典型免疫接种反应;对30、45、60日龄鸽保护率为100%;病毒纯净,无细菌和外源病毒污染。利用PPVNJ-18F1-E1致弱株研制鸽痘病毒弱毒冻干疫苗。该疫苗最小免疫剂量为0.5×103.54EID50;无细菌和霉菌污染;一次单剂量接种、单剂量重复接、一次大剂量接种对鸽均安全;对30、45、60日龄的鸽子,免疫保护率为100%,且免疫期长达7个月以上。
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