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第一部分外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定【目的】:探讨从人外周血分离、体外诱导培养和扩增内皮祖细胞(EPC)的方法体系,并进行细胞表型和功能的检测和鉴定。【方法】:采集正常成人外周血,以密度梯度离心法获得单个核细胞,在含有VEGF、bFGF等生长因子的M199培养液的培养条件下进行体外诱导、分化和扩增。于培养第7d应用流式细胞仪检测CD34、CD133;应用RT-PCR检测KDR(VEGRF-2);应用细胞免疫组织化学染色测定CD31;应用细胞免疫荧光方法检测Ⅷ因子;利用DiI-acLDL和FITC-UEA-1吸收试验检测内皮功能。【结果】:单个核细胞在内皮条件下培养,48h后逐渐贴壁,第3d细胞出现梭形或不规则形,并逐渐变大,第7d梭形细胞增多,部分视野观察到梭形细胞首尾相连形成条索样结构。应用流式细胞仪检测,培养7d的细胞CD34阳性率为36.31%,CD133阳性率为19.74%,双阳性率为18.63%;RT-PCR检测细胞表达KDR基因;细胞免疫组化和免疫荧光法测定,显示CD31阳性率为73.29%,Ⅷ因子阳性率为75.91%;>90%的细胞吸收DiI-ac LDL和FITC-UEA-1。【结论】:应用本研究方法从外周血途径分离、培养和扩增获得EPC,具有祖细胞的特征和内皮细胞的功能。第二部分基质细胞衍化因子-1对内皮祖细胞体外迁移的作用【目的】:研究基质细胞衍化因子-1(SDF-1)对体外培养、扩增的EPC迁移功能的影响以及SDF-1的受体CXCR4在EPC的表达。【方法】:体外培养、扩增第7d的EPC,采用细胞免疫组化和细胞免疫荧光的方法检测CXCR4的表达。应用Transwell小室进行细胞迁移实验,SDF-1浓度分别为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml,并设对照组,镜下观察并计数迁移至滤膜外侧面的细胞。【结果】:体外培养7d的EPC,细胞免疫组化染色CXCR4的阳性率为68.62,免疫荧光染色阳性率为74.78%。两者经检验无显著差异,P>0.05。综合二者结果,CXCR4阳性率为71.7%。细胞迁移实验显示,对照组、SDF-1浓度分别为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml时,细胞迁移数分别为3.5个,7.38个,24.88个和28.0个。SDF-1各浓度的细胞迁移数与对照组比较均有显著性差异(P<0.01),10ng/ml组与20ng/ml组、10ng/ml组与50ng/ml组相比较,P<0.01,20ng/ml组与50ng/ml组比较,P<0.05。【结论】:EPC表面存在CXCR4的受体,且有比较高的表达率;体外迁移实验表明EPC可在SDF-1的趋化作用下迁移,且与SDF-1的浓度呈正相关。第三部分基质细胞衍化因子-1在内皮祖细胞促血管新生中的作用【目的】:研究EPC移植入缺血模型裸鼠体内的存活以及分布情况;研究联合应用SDF-1能否加强EPC移植促血管新生的作用;研究内皮型一氧化氮合酶(eNOS)在缺血组织中的表达与EPC移植促血管新生的关系。【方法】:建立裸鼠单侧后肢缺血模型,将吸收FITC-UEA-1的EPC静脉注射裸鼠,于第3d和第7d处死动物并取出心、肝、肾和缺血后肢肌肉组织,冰冻切片并荧光显微镜下观察绿色荧光细胞在各器官组织中的分布。20只裸鼠模型分四组:静脉注射EPC和肌肉注射SDF-1(A组)、静脉注射EPC(B组)、局部肌肉注射SDF-1(C组)和肌肉注射培养液组(D组)作对照。术后观察动物缺血后肢的皮温及存活情况。于术后第7d取出缺血肌肉标本,检测毛细血管/肌纤维比值,应用免疫组化法检测缺血组织中CD31和eNOS表达情况。【结果】:吸收FITC-UEA-1的EPC移植入缺血后肢裸鼠,见后肢肌肉间隙较多绿色荧光细胞,在肾脏组织个别视野偶见少量绿色荧光细胞,在心脏和肝脏切片中未见绿色荧光细胞,移植第7d后肢肌肉标本中仍可见绿色荧光。20只裸鼠死亡2只,原因为一只静脉注射EPC时注液过多导致心衰死亡,另一只死亡原因不明。A组、B组、C组和对照组患肢保存率分别为80%、75%、20%和0。A组、B组、C组和对照组毛细血管/肌纤维比值分别为1.01,0.84,0.57以及0.46,A组和B组显著高于D组(P<0.01),A组显著高于B组、B组显著高于C组(P<0.05)。以CD31染色阳性表示血管密度,A组、B组、C组和D组血管密度值分别为15.2、10.0、5.8和2.4。A组和B组显著大于D组(P<0.01),C组显著大于D组(P<0.05),A组与B组、B组与C组相比较,P<0.05。在A组和B组的缺血肌肉中可见eNOS阳性表达,A组阳性率73.33%,B组阳性率为53.33%,两组经检验无显著差别。C组和D组未见eNOS阳性染色。【结论】:EPC经静脉移植后在缺血裸鼠可定向迁移至缺血组织局部。EPC移植能促进治疗性血管新生,联合应用SDF-1可增强EPC的作用。eNOS参与了EPC移植促血管新生的过程。结论由本研究,我们得到以下结论:1、从外周血分离、纯化、扩增EPC,可得到具有EPC表型和在体内促血管新生作用的细胞。为改变经骨髓获取EPC须麻醉且增加病人痛苦及经脐血获取EPC须解决免疫排斥、组织来源问题的弊端,以及改变直接使用未经分离纯化的单个核细胞可能导致的炎症反应和细胞旁系分化等潜在问题而建立一种简便快速的获取EPC的途径。2、EPC表面表达SDF-1的受体CXCR4,SDF-1可在体外诱导EPC迁移,且与SDF-1的浓度呈正相关。3、EPC经静脉移植后在缺血裸鼠可定向迁移至缺血组织局部。EPC移植能促进治疗性血管新生,联合应用SDF-1可增强EPC的作用。eNOS参与了SDF-1促进EPC血管新生的作用机制。为临床因合并心血管危险因素外周血EPC数量少、功能差的患者提供一种趋化因子疗法的治疗选择。本课题创新点有三:1、建立从外周血分离、纯化、扩增EPC的方法体系,以简便、快速地获取EPC;2、应用SDF-1加强EPC移植促血管新生的作用,国内文献未见报道;3、eNOS可能是SDF-1促进EPC血管新生的作用机制之一。