平邑甜茶MhWRKY15基因的克隆及表达分析

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转录因子是结合在目的基因特定DNA序列上的蛋白质,它通过增强或抑制基因的转录效率来调控基因的表达水平,真核生物的基因表达调控主要是在转录水平进行。WRKY转录因子作为一种重要的诱导型调节因子,参与植物的多种防卫反应、生长发育调节以及物质代谢调节等各种重要生理活动。平邑甜茶(Malus hupehensis (Pamp) Rehd. var pinyiensis Jiang)是我国特有的植物资源,常用作苹果和观赏海棠的砧木。本研究以平邑甜茶为试材,克隆了MhWRKY15基因的全长cDNA序列,并运用生物信息学手段分析了其基因序列与编码蛋白的性质和功能;同时,研究了其在生长过程及逆境胁迫下的表达情况,并成功构建RNAi载体并转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株。主要结果如下:1).获得了平邑甜茶MhWRKY15基因,该基因cDNA全长1091bp,含有810bp的完整开放阅读框,编码269个氨基酸,属于WRKY类转录因子的第II组,为WRKY15家族成员。GenBank登录号为GU576874。2).生物信息学分析表明, MhWRKY15编码蛋白为可溶性蛋白,其分子式为C1263H1941N365O425S12,相对分子量为29423.2Da,理论等电点为5.30;含有一个WRKY保守结构域,无跨膜域,无信号肽,存在磷酸化、N糖基化和O糖基化位点;其二级结构主要以无规则卷曲为主。3).构建了pCAMBIA1390-MhWRKY15-GFP表达载体,亚细胞定位结果表明平邑甜茶MhWRKY定位于细胞核。4).构建了基因沉默载体pFGC5941-RNAi-MhWRKY15,并通过花序侵染法转化拟南芥,通过抗性筛选和PCR检测,得到11株转基因再生阳性植株。5).半定量RT-PCR表明,平邑甜茶MhWRKY15基因的表达受NaCl、PEG、低温及机械伤害等胁迫诱导,并且具有组织特异性,叶片中的表达水平高于茎和根系。
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