猪β-防御素抗菌、抗氧化功能及其对肠上皮细胞黏膜屏障功能的影响

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本研究采用化学方法合成pBD-1和pBD-2,在研究pBD-1和pBD-2体外抑菌活性、体外抗氧化活性和细胞毒性等生物学功能的基础上,进一步利用实时荧光定量PCR研究了pBD-1和pBD-2对IPEC-J2细胞紧密连接蛋白和黏蛋白基因表达的影响。主要研究结果如下:   采用改良的微量肉汤稀释法研究了pBD-1和pBD-2对8种革兰氏阴性菌和3种革兰氏阳性菌的抗菌活性,并利用透射电镜初步探究了pBD-1和pBD-2可能的杀菌机制;试验还研究了pBD-1和pBD-2的体外抗氧化活性。体外抑菌试验结果表明,pBD-1对Escherichia coli EPEC078(:)K80和Bacillus subtilis ATCC6633具有较好的抑菌活性,最小抑菌浓度均为32μg/mL,pBD-2仅对Pseudomonas.aeruginosa CMCC10104有较好的抗菌活性,最小抑菌浓度为8μg/mL,对其它细菌抗菌活性较弱;透射电镜观察结果表明,pBD-1和pBD-2能够通过破坏菌体细胞膜杀灭细菌;抗氧化活性实验结果表明,pBD-1和pBD-2在0-256μg/mL范围内,具有清除自由基的功能和还原力,且呈现浓度依赖效应。pBD-1和pBD-2对红细胞的溶血率、对IPEC-J2的LDH释放率和细胞增殖率影响的实验结果表明,pBD-1和pBD-2的细胞毒性较小。上述研究结果揭示pBD-1和pBD-2可通过作用于细菌细胞膜对特定细菌发挥抗菌作用,同时还具有一定的抗氧化活性,且细胞毒性较低。   为研究pBD-1和pBD-2对肠道紧密连接蛋白和黏蛋白基因表达的影响,试验将25μg/mL、100μg/mL的pBD-1和pBD-2添加到IPEC-J2细胞中,采用实时荧光定量PCR检测pBD-1和pBD-2处理6h和24 h后,对IPEC-J2细胞中紧密连接蛋白和黏蛋白基因表达水平的影响。结果表明:处理6h后,25μg/mLpBD-1能够显著提高所检测紧密连接蛋白和黏蛋白基因的表达量,100μg/mLpBD-1能显著提高claudin4、Zo-1和MUC1的基因表达量,显著降低MUC20的基因表达量,对occludin和claudin3的基因表达没有影响;处理24 h后,25μg/mL pBD-1能显著降低occludin、Zo-1和MUC20基因的表达量,对claudin3、claudin4和MUC20没有显著影响,100μg/mLpBD-1显著提高MUC1的基因表达量,显著降低occludin和MUC20基因的表达量,对claudin3、claudin4的基因表达没有显著影响。除100μg/mL pBD-2对MUC20的基因表达量无显著影响外,处理6h和24 h后,25μg/mL、100μg/mL的pBD-2能够显著提高所检测紧密连接蛋白和黏蛋白基因的表达量。综上,25μg/mL pBD-1和pBD-2处理IPEC-J2细胞6h后,紧密连接蛋白(occludin、Zo-1、claudin3和claudin4)和黏蛋白(MUC1和MUC20)基因的表达量提高较多,随着pBD-1和pBD-2浓度增加或处理时间的延长其对紧密连接蛋白和黏蛋白的表达量无显著影响或显著降低其表达量。
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