禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)是引起鸡、鸭及其他禽类局部或全身性大肠杆菌病的病原,是一种重要的肠道外致病菌(Extraintestinal Pathogenic E.col,ExPEC)。APEC是养鸭生产中较为常见的病原菌,可感染任何年龄的鸭群,引起鸭的发病率和死亡率较高;剖检表现为典型的纤维性心包炎、肝周炎、气囊炎、腹膜炎及全眼球炎等。对家禽养殖产业造成巨大的经济损失。模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)是机体先天性免疫的重要组成部分,其能够识别病原相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Pattern,PAMP)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMP),进而激活下游信号转导通路,促进免疫相关基因的表达并诱导先天性免疫应答。NOD样受体(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)能够识别细胞质中的多种病原成分、组织损伤和细胞应激。其中NLRs中P亚家族的成员NLRP3,因为能够与细胞凋亡相关斑点样蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1形成一种细胞质复合物-炎性小体而被大家所熟知。很多研究已表明,NLRP3对促进炎性因子IL-1β、IL-18和TNF-α的表达,NF-κB信号通路的调控以及促进细胞凋亡方面具有重要作用。在人和鼠等哺乳动物中,NLRs能够识别细胞质中细菌的多种成分,如:细菌鞭毛、RNA、脂多糖、脂磷壁酸和肽聚糖上的胞壁酰二肽等。但有研究指出,鸭上存在的PRRs与其他物种的有一定差异。因此,为了明确鸭体内是否存在NLRP3受体,以及鸭NLRP3(duNLRP3)是否参与宿主的抗APEC先天性免疫应答,本研究首次获取了duNLRP3CDs的全长序列;明确了本实验所用菌株APEC O1K1所含的毒力基因、生长曲线及对樱桃谷肉鸭的致病性;检测了APEC感染后鸭体内外先天性免疫相关基因的表达情况;明确了duNLRP3在APEC感染诱导的先天性免疫中的作用;此外,我们还明确了duNLRP3在细胞内的亚定位,以及对NF-κB和DEFs细胞凋亡的诱导作用。具体主要包括以下五部分内容:1.DuNLRP3的克隆鉴定及生物信息学分析在本研究中,我们以健康鸭脾脏cDNA为模板获取了duNLRP3 CDs的全长序列。发现duNLRP3的全长CDs序列为2805 bp,编码934个氨基酸(GenBank no.为MH373356.1)。通过软件分析我们发现,duNLRP3蛋白是一种无信号肽、无跨膜域、不稳定的亲水性蛋白,并含有3个潜在的糖基化位点。通过SMART软件进行功能域的分析表明,duNLRP3蛋白均含有中间的NACHT结构域,C端的LRR重复结构域,以及N端的PYD结构域。同源性和进化树分析表明,duNLRP3蛋白位于Bird分支上,且与Gallus的同源性较近,与哺乳动物类的同源性较远。2.APEC对樱桃谷肉鸭的致病性研究首先,我们通过多重PCR的方法明确了应用于本实验的APEC O1K1分离株主要含有aatA、tsh、fimC、mat、ibeB、vat、yijp、ompA、neuC、cva/cvi、iss、iroN、fyuA和irp2等毒力基因。这些强毒力基因的含有是导致该分离株对鸭具有强致病性的原因。此外,该分离株的生长曲线显示:2-6 h为该菌的对数生长期、6-14 h为稳定期、14 h之后为该菌的衰亡期。细菌含量检测表明,APEC在感染后的第2天即达到了峰值,可以在肝、脾和脑等多个组织器官中进行快速有效的繁殖。此外,在细菌感染后的第2天,被感染鸭即表现出典型的临床症状和组织病理变化。这些结果表明,APEC能够导致鸭的严重感染,造成机体广泛的组织损伤和功能障碍。3.APEC感染诱导的先天性免疫应答为了获知宿主早期对APEC的抗感染反应,我们研究了APEC感染后肝、脾和脑以及鸭胚成纤维(duck embryo fibroblasts,DEFs)细胞中先天性免疫相关基因的表达情况。我们发现:肝脏中TLR4的mRNA表达量在APEC感染后第1天和第3天均表现为显著上调;脾脏中TLR2、4、5和15在APEC感染后的第2天均表现为极显著的上调;在大脑中,四种TLRs在细菌感染后的第1天和第2天均表现为极显著的上调,而在第3天时上调倍数急剧减小或表现为下调。这一现象表明在APEC感染初期,TLRs在调节宿主的先天性免疫过程中发挥了重要作用。此外,APEC感染后肝、脾和脑中AvBD2和16的上调倍数较显著,而AvBD4、5、7和9却主要表现为下调。在APEC感染后1-3天肝、脾和脑中促炎因子IL-1β的mRNA表达水平均表现为上调;IL-6作为一种主要的促炎因子,在肝和脾中表现出显著的上调;另一种促炎因子IL-8的mRNA表达量在上述三种组织中均表现出稳定且显著的上调,尤其是在脑中,APEC感染后的1-3天,IL-8稳定上调12-14倍;作为抑炎因子之一,IL-10的表达量在肝、脾和脑中也有不同程度的增加。此外,细菌感染后1-3天肝、脾和脑中MHC-I的mRNA表达水平均表现为上调,然而MHC-II却表现为极显著的下调。这些结果表明,APEC感染引起了宿主的炎症反应。体外实验的结果与体内结果基本一致,表明APEC感染后能诱导宿主产生大量的TLRs(如TLR2),AvBDs(如AvBD2),ILs(如IL-6和IL-8)以及MHCs(如MHC-I),而这些因子的过量表达(尤其是IL-6和IL-8)可能会导致机体发生过度的炎症反应,进而对宿主细胞造成一定的损伤。4.DuNLRP3介导的抗APEC先天性免疫研究我们研究了duNLRP3在健康鸭组织中的分布情况,发现胰腺中的表达量最高,而在食管及回肠等肠道组织中的表达量较低。这些结果表明duNLRP3在健康鸭组织中分布广泛且差异较大。在APEC感染后1-3天,肝脏中duNLRP3均表现为上调;脾脏中却均表现为下调;脑中duNLRP3仅在APEC感染后第2天和第3天表现出极显著的上调。这些结果表明duNLRP3参与了APEC感染宿主后诱导的先天性免疫应答。通过慢病毒介导的duNLRP3过表达和Si-RNA敲弱DEFs细胞中duNLRP3的表达发现:过表达duNLRP3能够显著的抑制APEC在体内和体外的增殖;同时,过表达duNLRP3后肝、脾和脑中IL-1β在细菌感染后的第2天和第3天均表达为极显著的上调;IL-18和TNF-α在脑中的上调倍数显著小于肝和脾中的上调倍数。同样的结果也在NLRP3慢病毒载体感染的DEFs细胞中发现,特别是在APEC感染后,IL-1β、IL-18和TNF-α的表达量均表现出显著的上调。而当duNLRP3被敲弱后,能显著的降低APEC感染所诱导的DEFs细胞中IL-1β和IL-18的mRNA表达水平,但对TNF-α的抑制作用不显著。这些结果表明过表达duNLRP3能显著的诱导APEC感染后宿主细胞中炎性因子的产生。5.DuNLRP3介导的抗APEC感染信号通路初步研究通过实验我们发现duNLRP3主要表达于细胞质中,同时在细胞核内也有一定的表达。此外,我们通过pc-duNLRP3分别与pGL3-NF-κB-luc、pGL3-IFN-β-luc和pGL3-IRF-7-luc的共转染,并结合双荧光素酶报告基因检测技术,研究了duNLRP3对NF-κB、IFN-β和IRF-7启动子的激活作用。我们发现单纯过表达duNLRP3,对NF-κB和IRF-7启动子活性的上调作用均不显著,而IFN-β启动子的活性反而表现为轻微的下调;在APEC或LPS刺激下,过表达duNLRP3能够极显著的增强NF-κB的活性,但对IFN-β和IRF-7启动子的激活作用却不明显,且LPS刺激所诱导的启动子活性较APEC感染所诱导的活性更高。此外,pSi-NLRP3的转染实验也证明了在APEC或LPS刺激下duNLRP3对NF-κB的显著的激活作用。这些结果表明,duNLRP3能够显著诱导APEC感染或LPS刺激下NF-κB的激活。与此同时,过表达duNLRP3能显著的促进DEFs细胞的凋亡,尤其对APEC感染后DEFs细胞早期凋亡的促进作用尤为显著。