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【目的】系统检测mi RNA在Dysferlin肌病中的表达,初步探讨mi RNA与Dysferlin肌病的关系;结合靶基因预测及细胞学实验,探讨mi R-708 mimic对成肌细胞的影响。【方法】1.结合临床表现、HE染色和肌酶特殊染色、免疫组化等方法,筛选Dysferlin肌病病例为实验组,非特异性改变肌组织为对照组,取部分组织行mi RNA芯片分析。2.靶基因预测网站预测作用于DYSF基因的mi RNA,结合mi RNA芯片结果,选择与dysferlin肌病关系密切的mi RNA,Taqman探针实时定量PCR(RT-PCR)检测其在人肌肉组织及小鼠成肌细胞C2C12增殖和分化过程中的表达。3.合成mi R-708 mimic,转染成肌细胞C2C12,光学显微镜下观察成肌细胞生长分化情况,利用CCK-8检测mi R-708 mimic对C2C12细胞生长增殖的影响,用流式细胞术检测转染mi R-708 mimic后的增殖期C2C12细胞周期和凋亡情况,RT-PCR、Western blot检测肌细胞增殖分化相关基因的表达。【结果】1.免疫组化显示:dysferlin蛋白在正常肌细胞的肌膜上呈线性表达,而在Dysferlin肌病组织中,dysferlin蛋白表达明显减弱或缺失。光镜下Dysferlin肌病组织病理学改变:肌纤维呈轻-重度圆形萎缩伴多量肥大肌纤维形成,散在肌纤维见镶边空泡,个别肌纤维溶解坏死,内核纤维明显增多,间质纤维脂肪组织增生。2.mi RNA芯片结果显示:Dysferlin肌病组织,116个mi RNA表达上调,176个mi RNA表达下调,部分mi RNA表达水平异常与肌病时细胞内各种酶活性的调节、细胞代谢的调控及MAPK、Wnt信号通路等病理过程相关。结合芯片结果与靶基因预测结果,选择与DYSF基因关系密切的3个mi R(-122、-346、-708)。其中mi R-122、-346下调,mi R-708上调。3.筛选9例Dysferlin肌病标本进行mi RNA检测,与非特异性改变肌组织对比,mi R-122、-346、-708表达均升高(P值分别为0.04,0.04,0.03),其中mi R-708在Dysferlin肌病患者肌组织的表达模式与芯片结果一致。4.检测mi R-122、-346、-708在C2C12成肌细胞生长分化过程中的表达,显示增殖期mi R-122、-346、-708表达量较低,分化早期mi R-122、-346、-708均升高,但随着C2C12分化时间的延长,mi R-122表达水平基本不变,mi R-346、-708表达下调,其中mi R-708下调更明显,达到增殖期水平。5.C2C12细胞转染mi R-708 mimic后,光学显微镜下可见成肌细胞增殖受到明显抑制。CCK-8检测显示mimic组C2C12抑制率为(15.40±0.0052)%,(P=0.004),明显高于NC组(2.87±0.0034)%;流式细胞术结果显示:转染mi R-708 mimic后,C2C12细胞周期变化明显,S期明显缩短(20.87%),G1期明显延长(68.64%),NC组分别为45.66%、42.69%,而细胞凋亡指数mimic组与NC组无显著差异;RT-PCR及Western blot结果显示:与阴性对照(NC组)相比,转染mi R-708mimic后MYOD、MYOG、MHC、DYSF蛋白表达水平无明显变化。【结论】1.Dysferlin肌病可引起多种mi RNA表达模式的改变,这些mi RNA可能通过肌动蛋白骨架形成的调控、细胞内各种酶活性的调节、细胞代谢的调控及MAPK、Wnt信号通路的调节等环节参与Dysferlin肌病病理生理过程。2.Mi R-708可能是成肌细胞增殖的调控分子,但与成肌细胞分化和凋亡无明显相关,其在Dysferlin肌病中的作用机制有待于进一步探讨。