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N-乙酰-β-D氨基葡萄糖(Glc NAc)是形成几丁质(又名甲壳素)的基本单位,它以β-(1,4)糖苷键聚合而成线状多聚物——几丁质。Glc NAc是葡萄糖衍生物,具有重要的生物功能,不仅是许多植物、真菌细胞壁的组成成分和昆虫外壳的结构成分,也是哺乳动物和人体结缔组织、关节中糖蛋白的重要成分。Glc NAc还具有抗菌消炎、预防骨关节疾病、促进伤口愈合等作用,因此在医药、保健品、食品和化妆品等领域具有广泛的应用。Glc NAc主要以几丁质为原料来生产,几丁质广泛存在于真菌、酵母等的细胞壁、或昆虫及虾蟹等的外骨骼中,是自然界中含量仅次于纤维素的天然多糖物质,全球每年水产产品消费后产生的废弃物中,几丁质的含量就超过了数千万吨,需要加以综合利用,变废为宝。传统的方法是使用浓酸、强碱将几丁质降解成N-乙酰氨基葡萄糖单体,这种化学方法水资源消耗大,而且环保压力大,因此,发展环境友好、条件温和的酶法水解几丁质成为了研究热点。酶法降解几丁质制备Glc NAc,具有易控制、产物纯度和得率高等优点。通过几种酶的联合水解,可提高生产效率和产品得率。例如几丁质酶能将几丁质水解成壳二糖,进一步在N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAGases)的作用下水解成Glc NAc。因为NAGases是外切酶,活性普遍偏低,酶法制备Glc NAc的效率较低,因此,我们希望能提高NAGases的表达量和酶活力,增强胶体几丁质的酶解效率。本研究中,我们首先在毕赤酵母中成功了表达了来源于枯草芽孢杆菌的乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶Bs Nag Z,按毕赤酵母的密码子偏好性,优化并合成枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168来源的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因nag Z,将合成的Bsnag Z基因克隆至表达载体p PICZαA上,转入毕赤酵母X33菌株中,成功进行了异源表达;通过不断提高Zeocin抗性素的浓度,筛选到一株Bsnag Z基因4拷贝整合的菌株,其发酵上清的酶活力达到3.2 U/m L,与单拷贝相比,酶活力提高了4.17倍。对重组酶进行酶学性质分析:最适温度60°C,最适p H 6.0。同时,重组酶具有良好的稳定性:在p H 4.5-10预处理12 h,仍保留80%以上的酶活力;将该酶置于50°C预处理1 h后,仍有80%的残余酶活.将重组Bs Nag Z应用于胶体几丁质的酶解中。酶解结果表明,Nag Z在50°C条件下酶解效果较好,在400μL酶解体系中加入150μL(7.5 U/m L)的Nag Z酶液,250μL 3%胶状几丁质底物,水解1 h后可以检测到N-乙酰氨基葡萄糖单体产生,但是产量极少。进一步通过偶联几丁质酶,几丁质酶先将胶体几丁质水解为二糖,再在Nag Z的作用下水解成Glc NAc,产物量有了很大的提升。其次,为了获得更多、更好的NAGase资源,我们根据Bs Nag Z的氨基酸序列在NCBI基因组数据库中筛选出来源于Bacillus coagulans DMS1的Nag Z基因Bc Nag Z,以及来源于Bacillus lichheniformis WX02的Nag Z基因Bl Nag Z,将两个基因都克隆到p ET-26b载体上,并在大肠杆菌中成功表达,通过对重组蛋白进行酶学性质进行研究,Bl Nag Z和Bc Nag Z的最适p H都为6.0,而Bc Nag Z的最适温度为75°C,较Bl Nag Z的60°C高。比较两种蛋白的表达水平和酶活力,Bl Nag Z酶活力更高、表达情况更好,因此对Bl Nag Z的诱导表达条件进行了优化,优化后,发酵上清的酶活力达到13.2 U/m L,提高了10倍。最后,将重组Nag Z应用于胶体几丁质的酶解中。酶解结果表明,Nag Z在50°C条件下酶解效果较好,在400μL酶解体系中加入150μL的Nag Z酶液,250μL 3%胶状几丁质底物,水解1 h后可以检测到N-乙酰氨基葡萄糖单体产生,但是产量极少。进一步通过偶联几丁质酶,几丁质酶先将胶体几丁质水解为二糖,再在Nag Z的作用下水解成Glc NAc,产物量有了很大的提升。而且由于Bl Nag Z的比酶活力较Bs Nag Z高,在同等酶量的情况下,Bl Nag Z的水解效率更快。综上所述,本研究首次将Bs Nag Z在毕赤酵母进行异源表达,并通过Zeocin抗性筛选提高基因的拷贝数,从而提高重组Bs Nag Z的表达量。同时将Bs Nag Z应用于胶体几丁质的酶解实验中,水解其产生Glc NAc单体。并通过偶联几丁二糖酶,可有效降解胶体几丁质,增加Glc NAc的产量。为了得到酶活力更高的Nag Z,我们在大肠杆菌中异源表达了来源于Bacillus coagulans DMS1的nag Z基因(Bc Nag Z),以及来源于Bacillus lichheniformis WX02的nag Z基因(Bl Nag Z),并对Bl Nag Z的发酵表达优化,得到的酶液也进行酶解实验,结果显示重组Nag Z能水解胶体几丁质得到单糖。本文为酶法高效生产Glc NAc奠定了基础。