天然高分子凭借其生物相容性好、可降解、易修饰等多种性质,已成为制备纳米材料的主要基材。通过自组装制备的天然高分子纳米载体更是由于其安全无毒、制备简单、表面易修饰、载药量高、控释性能好等优势,在药物及营养素递送方面受到越来越多的关注。目前,提高纳米粒子的稳定性和功能性,并实现高效靶向递送,已成为递送领域研究的研究热点。本文以玉米醇溶蛋白(zein)为主要基材,通过自组装的方式与两种不同形式的多糖(阴离子多糖—羧甲基纤维素钠和阳离子多糖—季铵盐壳聚糖)自组装形成纳米粒子。以疏水性药物紫杉醇(PTX)和疏水性营养素姜黄素(Cur)为模型负载物,研究纳米运载体系对疏水性物质的包封、保护以及体外缓释的性质,通过细胞实验验证载药纳米粒子的生物学特性。为进一步提高抗癌药物的疗效、降低毒副性,赋予运载体系定向性释放的性质,在已制备的纳米粒子表面形成一层单宁酸-金属离子包被膜,通过膜的pH-响应性崩解,赋予纳米粒子pH-响应性释药的性质。本文主要研究结果如下:1.选择PTX作为疏水模型药物,通过自组装方法制备负载PTX的玉米醇溶蛋白/羧甲基纤维素钠纳米粒子(PTX-zein/CMC纳米粒子)。结果显示当蛋白质与多糖质量比为1:3,投药量为80μg/mL时,所得纳米粒子粒径为159.4 nm,载药率高达93.5%。在此条件下可得到分散均匀的球形纳米粒子,且其具有良好的pH稳定性和储藏稳定性。体外缓释实验表明,相比于游离药物的快速释放,载药纳米粒子呈现明显的缓释特性。细胞吞噬实验表明,药物敏感的HepG2细胞和药物抗性的MCF-7细胞对香豆素6标记的纳米粒子的细胞吞噬均呈时间依赖性。同时,对于药物抗性的MCF-7细胞,在高给药浓度下,载药纳米粒子比游离药物显示更强的细胞毒性。细胞凋亡实验显示,对于抗性细胞,载药纳米粒子组引起的细胞凋亡比例大于游离药物的。免疫荧光实验表明载药纳米粒子和游离的PTX均是通过促进微管的增生导致细胞凋亡。2.研究阳离子多糖(季铵盐壳聚糖,HTCC)与zein的组装行为,利用自组装制备纳米粒子,用于疏水性营养素Cur的负载。通过对壳聚糖季铵化改性,大大提高了壳聚糖在中性条件以及碱性条件下的溶解性。改变蛋白质/多糖质量比可以得到不同粒径、不同多分散系数(PDI)、不同负载率的纳米粒子。当固定多糖为HTCC1(Mw 8.708×103),蛋白质/多糖质量比为1:1时,所得纳米粒子的负载率最高。与单纯的zein纳米粒子相比,形成的zein/HTCC纳米粒子分布更加均匀,形状更加规整。将Cur负载于纳米粒子可显著提高其光、热稳定性,且在相同的处理条件下相比于游离Cur具有更强的抗氧化活性。3.为了进一步提高构建的递送体系的高效性,在之前的研究基础上,引入了具有pH响应性的响应因子。基于单宁酸(TA)分子与蛋白质之间具有较强相互作用的邻苯三酚结构及其优异的金属螯合能力,以金属离子为交联剂在zein纳米粒子表面形成一层金属-有机涂层,成功构建了一种新型的具有pH响应性的纳米载体(zein-TA/metal纳米粒子)。通过透射电子显微镜(TEM)对其微观形貌进行观察,发现这种杂化纳米粒子具有更佳的分散性且粒径更加均一,克服了大部分纳米粒子在培养基中不稳定的问题。傅里叶红外光谱(FT-IR)分析表明,TA与金属离子之间存在较强的配位作用,同时TA与蛋白质之间也存在着氢键相互作用与静电相互作用。使用X射线光电子能谱(XPS)对纳米粒子表面元素进行分析,金属离子特征峰的出现以及C/O比值的显著变化均有效证明TA与金属离子的引入。随后以阿霉素(DOX)为模型药物,对其包封率、缓释性能进行研究。结果显示,相比于zein纳米粒子,包被纳米粒子对药物的包封率显著提高且在中性条件下(pH=7.4)具有良好的缓释性能,阻止了突释现象的发生。同时,由于TA-CuII复合膜具有pH响应性,赋予包被纳米粒子良好的pH响应性释药的性质。细胞吞噬实验表明,与游离的DOX相比,通过内吞作用进入细胞的纳米粒子速度较缓慢;对于包被的纳米粒子,由于对药物的pH响应性释放,孵育较长时间才能观察到细胞内DOX的红色荧光。位于包被纳米粒子表面的TA可以原位还原金纳米粒子,该体系为癌症的光热疗法提供了新思路。4.为了能更加精细的调控纳米载体的pH响应性,利用TA对基体的粘附性以及金属螯合能力、氨基与金属之间的配位作用,在zein纳米粒子中引入含有氨基的HTCC,在制备的zein/HTCC纳米粒子表面包被一层金属-有机涂层。同时利用TA-金属离子以及氨基-金属离子之间配位键的pH响应性,赋予纳米粒子pH响应释药的特性。与zein/HTCC纳米粒子相比,形成的包被纳米粒子(zein-HTCC/TA-metal纳米粒子)分散性更好,粒径分布更加均匀,形状更加规整。FT-IR研究表明,TA与金属离子之间存在较强的配位作用;同时TA,HTCC与蛋白质之间也存在着静电相互作用。XPS研究进一步验证了包被纳米粒子表面金属离子和TA的存在。以DOX为药物模型研究发现,包被的纳米粒子对药物的包封率相比于zein/HTCC纳米粒子也有显著的提高。体外缓释实验表明以不同金属离子作为交联中心及金属离子添加量的变化均会导致载药纳米粒子释放行为的变化。与zein-TA/metal纳米粒子相比,zein-HTCC/TA-metal纳米粒子呈现出更优异的刺激响应性。细胞吞噬实验显示未经包被的纳米粒子存在明显的突释现象,在培养基中即可快速释放DOX。对于包被纳米粒子,由于对药物的pH响应性释放,孵育较长时间才能观察到较强的荧光。同时引入稀土元素,使其同时具有pH响应性和生物成像的功能。5.考察金属离子种类及化学计量比对TA-金属离子包被纳米粒子(zein-TA/metal)性质的影响。金属离子种类可显著影响壳层厚度致使纳米粒子的粒径不同;金属离子浓度的增加会引起包被纳米粒子粒径的增加。在较低金属离子浓度下,包被的纳米粒子在培养基中的稳定性大大提到。但是对于TA-CuII包被的纳米粒子,随着金属离子浓度的增大,形成的纳米粒子在培养基中稳定性减小。随后的FT-IR分析得出金属离子的含量显著影响TA与金属离子的配位作用,从而影响包被纳米粒子吸收峰的移动;XPS进一步验证包被纳米粒子中金属离子以及TA的存在,且金属离子的浓度影响包被纳米粒子表面元素含量。细胞吞噬实验表明细胞对zein纳米粒子和zein-TA/metal纳米粒子的吞噬均呈现时间及浓度依赖性。细胞对包被纳米粒子表现出更快的吞噬速率以及更高的吞噬量。金属离子种类以及添加量影响细胞对纳米粒子的吞噬效率。通过激光共聚焦显微镜(CLSM)观察短时间细胞吞噬,细胞对包被纳米粒子粘附性更强,纳米粒子进入细胞速率更快。网格蛋白介导的吞噬作用是包被纳米粒子进入细胞的主要途径。同时包被纳米粒子进入细胞,细胞膜穴样凹陷介导的吞噬作用也可能起到一定作用。对于zein纳米粒子,胞饮作用对于纳米粒子进入细胞至关重要。进入到细胞内的纳米粒子可以和细胞质内溶酶体共定位,观察发现纳米粒子没有进入核区。