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目的:脊髓损伤( spinal cord injury,SCI )是临床常见病、多发病,致残率高。近年来,嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植治疗SCI在实验和临床治疗中取得了初步成功[1-4],被认为是治疗SCI最有效的方法之一。目前SCI临床移植治疗应用的OECs基本上来源于流产胎儿的嗅球,其来源少,具体时间、地点不确定,而SCI发病的时间和地点也存在着不确定性,使得细胞来源和需求不能很好衔接。为解决上述问题,本课题组进行了OECs低温保存与其细胞活性关系的研究。本实验是在以上实验的基础上,将低温保存3个月的OECs复苏后局部移植治疗SCI,从行为学和形态学等方面与新鲜OECs移植进行对比,探讨低温保存后的OECs移植治疗SCI的疗效,为临床实际应用提供理论依据。材料与方法:取2.0个月龄雄性健康Wistar大鼠的嗅球,进行OECs培养和纯化,收集处于对数生长期的OECs,以5%DMSO-6%HES作为低温保护剂,采用冰箱降温液氮保存方式将其低温保存3个月后,用慢冻快融的方法复苏,将部分OECs用双苯亚甲胺标记,移植到大鼠脊髓半切损伤模型。实验分为新鲜OECs局部移植组(A组),冻存OECs局部移植组(B组),DMEM/F12培养液移植组(C组)和空白对照组(D组)共四组。术后分期对各组模型进行联合行为学(CBS)评分,并观察脊髓损伤区OECs存活及迁移情况,以及组织学和免疫组织化学的变化,评价各组SCI修复情况。结果:应用差速贴壁和Ara-c抑制相结合的纯化培养方法培养出纯度较高的OECs,胞体为梭形、扁圆形和多突起形三种形态,呈神经生长因子受体(NGFRP75)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色阳性反应。从CBS评分来看,移植术后1-10周,各组评分值随着时间的延长均减小。其中,A组和B组变化最为明显, A、B两组较C组和D组在2周后各时段差别均有显著意义(P<0.05),A组和B组之间无明显差别(P>0.05),C组和D组之间亦无明显差别(P>0.05)。从组织学方面来看,HE染色和嗜银染色见各组均有轴突再生,与C、D两组比较,A、B两组有较多的再生轴突,并有再生神经纤维通过损伤区,且两组间差别不明显。免疫组化染色无论5周还是10周,A、B两组在损伤部位均可见阳性染色区域, OECs黄染,且有大量包绕OECs髓鞘的轴突再生,部分再生轴突穿越损伤区域,A组与B组无明显差异, C、D组未见有阳性着色。术后5周时荧光显微镜下A、B组可检测到标记的OECs,C、D组未发现蓝色荧光颗粒;10周时各组标本均未见有蓝色荧光颗粒存在。结论:1.低温保护剂5%DMSO-6%HES +冰箱降温液氮保存相结合低温保存OECs ,是一种简便、经济、有效的保存方式。2.低温保存3个月的OECs复苏后局部移植治疗SCI,与新鲜OECs的疗效相似,且移植到局部的OECs可在SCI区存活和迁移,证明低温保存的OECs局部移植治疗SCI是可行的。3.OECs低温保存3个月局部移植治疗SCI仍具有较佳疗效,从时间上较好的解决了细胞来源和临床移植治疗不衔接的问题,为临床实际应用提供了理论依据。