近年来,奶山羊产业发展迅速,随着养殖规模的扩大,呼吸系统疾病已成为奶山羊养殖中危害最大的疾病之一。多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和大肠杆菌均是羊呼吸系统疾病的致病菌,三者经常混合感染,难以进行针对性用药,治疗难度大,故应采用以免疫接种为主的措施加以预防。目前尚无针对此类疾病的羊用疫苗,这使关中地区养羊业遭受了巨大的经济损失。为了减少呼吸系统疾病导致的巨大危害,预研制一种羊多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和大肠杆菌三联灭活疫苗,旨在对当地流行致病菌株起到良好的预防效果。本研究从关中奶山羊病变肺脏组织分离致病菌,通过染色镜检、生化试验、16s r RNA测序完成鉴定,并通过药敏试验、半数致死量试验对其耐药性和致病性进行了研究。将三种细菌用终浓度0.3%的甲醛溶液灭活后浓缩纯化,分别加入弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂,制备出两种三联灭活疫苗。进行性状检验和安全性检验后,注射小鼠和羊,通过微量平板凝集试验检测血清抗体效价,并通过免疫保护试验探究疫苗对机体的保护作用。试验结果如下:1.从12份关中奶山羊肺脏病料中分离出多杀性巴氏杆菌7株,分离率为58.3%;溶血性曼氏杆菌2株,分离率为16.7%;大肠杆菌6株,分离率为50.0%。筛选出多杀性巴氏杆菌强毒株PM01、溶血性曼氏杆菌强毒株MH01、大肠杆菌强毒株EC01用于疫苗制备。药敏试验中,PM01对14种药物中的3种具有耐药性,MH01对全部药物敏感,EC01耐药情况比较严重,在14种药物中对8种表现耐药。小鼠半数致死量试验中,PM01的LD50为6.339×10~4CFU,MH01的LD50为6.325×10~8CFU,EC01的LD50为9.290×10~7CFU。分离株均可造成小鼠肺部病变,小鼠易感染多杀性巴氏杆菌,对溶血性曼氏杆菌不太敏感。2.将三种抗原均浓缩至2.0×1010CFU/m L后,制备出两种佐剂的多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和大肠杆菌三联灭活疫苗,疫苗检验合格。注射后通过对小鼠和羊血清抗体效价的检测,发现两种佐剂的疫苗均能刺激机体产生免疫应答,首次免疫后血清抗体效价的变化不明显,加强免疫后血清抗体效价明显提升,弗氏佐剂疫苗注射后产生的抗体水平整体高于氢氧化铝佐剂疫苗注射后产生的抗体水平。小鼠免疫保护试验中,以5倍LD50剂量注射后,弗氏佐剂疫苗对多杀性巴氏杆菌攻毒的保护率为100%,对溶血性曼氏杆菌攻毒的保护率为40%,对大肠杆菌攻毒的保护率为80%;氢氧化铝佐剂疫苗对多杀性巴氏杆菌攻毒的保护率为80%,对溶血性曼氏杆菌攻毒的保护率为40%,对大肠杆菌攻毒的保护率为60%。通过对肺脏、肝脏、脾脏的剖检以及组织形态学观察,证明疫苗对小鼠内脏器官具有一定的保护效果。本研究是国内首个关于羊多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和大肠杆菌三联灭活疫苗的研究。经过评估,疫苗免疫效果良好,能有效预防呼吸系统疾病,具有推广应用的价值,有助于解决奶山羊养殖中针对呼吸系统疾病无合适疫苗可用的难题。