论文部分内容阅读
植物内生真菌是一类生长在健康植物组织中的特殊真菌,其种类丰富、来源广泛,是新的天然活性产物的主要来源之一。目前已从各种植物中分离出多种具有生物活性的内生真菌,其次级代谢产物均具有不同的生物活性,如抗肿瘤活性、抗菌、植物生长调节剂类以及抗氧化活性等。植物内生真菌由于其特殊的生长环境,在医药开发、工农业生产及环境保护等领域具有广泛的应用前景。本论文从健康银杏组织中分离出32株内生真菌,利用DPPH抗氧化模型测定32株内生真菌的抗氧化活性,从中筛选出8株抗氧化活性较为稳定、抗氧化活性较高的菌株,并对其抗氧化活性进行复筛。复筛采用DPPH法对8株菌株菌丝体的抗氧化活性进行测定,为获得优良菌株提供进一步的参考。结果表明,菌株GCZX015具有较高的抗氧化活性,因此,对其进行进一步的研究。采用经典形态学和分子生物学相结合的方法对菌株GCZX015进行鉴定,结果表明,菌株GCZX015与球毛壳菌的rDNA序列具有较高的的同源性,达99%,且与球毛壳菌形态特征比较的结果一致,初步确定该菌株为球毛壳菌。采用单因素实验法确定了菌株GCZX015生长的最佳条件为：最适生长温度为25℃、转速170r/min、培养时间8d、接种量5%、装液量为100mL/250mL,生长的pH范围较宽,但在pH为6.5时产物活性最高。同时,考察了营养性因素对菌株GCZX015产物抗氧化活性的影响。根据Plackett-Burman实验结果确定了硫酸镁、马铃薯以及发酵液pH对菌株生长具有显著的影响。采用响应面优化法对马铃薯、硫酸镁以及培养基初始pH进行优化,得到三个条件的最佳组合：为马铃薯含量为209.5420g/L、硫酸镁浓度为0.0019mg/mL、pH为6.4132,在此条件下,自由基清除率理论值为96.51%。对菌株GCZX015的大规模发酵液通过离心、醇沉、冻干等处理,将冻干粉溶于甲醇,通过硅胶柱色谱对冻干粉甲醇溶液进行分离。柱层析分离得到的样品通过薄层层析进行合并,收集到6个样品,分别测定6个样品的抗氧化活性,其中2号样品的抗氧化活性最大为97.03%。在此基础上,利用制备型色谱对2号样品进行进一步的分离纯化,获得2-1组分,其抗氧化活性为97.37%。利用高效液相色谱和液-质联用仪进行定性分析,初步确定发酵液当中的抗氧化活性成分主要为槲皮素。