研究背景:植物天然产物在抗肿瘤方面发挥着至关重要的作用。近年来,啤酒花提取物黄腐酚(Xanthohumol,XN)因其广泛的生物学活性引起了人们的普遍关注。其中,自由基生物学相关的活性机制常常会得到较早的研究。作为黄酮类多酚化合物,XN的抗氧化活性自2000年开始首先得到了广泛的研究和报道;但令人困惑的是,自2007年以来,XN的促氧化活性却也陆续在多种细胞上获得发现。我组前期研究同样发现,XN处理人急性髓系白血病细胞系HL-60细胞表现出了较强的促氧化活性。但是,XN为什么会在细胞水平上屡屡表现出促氧化活性,个中原因却仍未解决。因此,详细解析XN在细胞水平上促氧化的具体情况,对XN促氧化活性本质的揭示就显得尤为重要。研究目的:解析XN促进HL-60细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成的规律及其对细胞命运的影响,探索ROS生成机制研究细胞模型所需的合适条件,为进一步的ROS生成机制研究创造条件。研究方法:由于普通细胞培养过程中添加的血清对于ROS具有很强的清除活性,因此我们用于检测ROS生成的实验系统选择为无血清体系。具体方法有:应用ROS荧光探针DCFH-DA、使用流式细胞术检测细胞ROS产量,并通过对流式细胞术结果的点状图(dot plot)数据的分析,研究细胞碎片出现情况;通过乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)释放实验检测细胞破碎程度,并结合台盼蓝细胞计数检测细胞数目的改变;应用活细胞成像系统观察细胞形态的变化以及结合PI荧光染色研究细胞膜通透性的改变;应用annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡发生情况;应用酶联免疫法检测IL-1β的释放;应用蛋白免疫印迹技术检测凋亡、焦亡、程序性坏死等程序性细胞死亡方式的标记蛋白Caspase-3、GSDMD、MLKL的表达情况。研究结果:研究发现(1)10μM XN能够诱导HL-60细胞ROS的急剧爆发,但在更高浓度的XN作用下(20和40μM)检测到的ROS水平却急剧下降。流式数据点状图分析发现,20和40μM XN处理造成了HL-60细胞出现大量碎片,提示发生了严重的细胞破碎现象。(2)LDH释放实验和台盼蓝计数实验证实了细胞破碎、LDH释放到培养液中、细胞数目下降这些现象的发生。同时,用抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)进行干预,发现NAC能够减弱LDH的释放量,并使细胞数目的下降情况得到缓解。提示抗氧化剂NAC对XN导致的HL-60细胞破碎具有保护作用,细胞破碎与ROS的产生相关。(3)活细胞成像观察结果发现,XN处理导致HL-60细胞迅速膨胀、PI荧光染色结果显示质膜通透性增加,NAC干预能有效缓解这些影响。提示细胞发生了ROS相关的膜通透性增加。(4)为了进一步解析该急性死亡的类型,检测了细胞凋亡、细胞焦亡和程序性坏死这三种主要类型的细胞死亡。结果表明,这种急性细胞死亡并不属于上述死亡方式。很可能就是因为ROS的大量爆发导致的细胞急性坏死。(5)最后,我们探讨了研究ROS生成机制所需细胞模型的建立条件。实验发现,10%血清的存在可以完全掩盖10μM和20μM XN诱导的ROS升高现象,细胞碎片也近乎消失;1%到10%不同浓度血清对10μM XN产生ROS影响的研究结果表明2%浓度的血清已能够完全掩盖ROS的生成。可见,在研究ROS生成的详细机制时,实验系统中要排除血清的存在;而针对无血清体系造成的细胞碎片增加的弊端,需要通过剂量依赖曲线,综合考虑ROS产量和细胞碎片这一对矛盾,选择ROS产量变化的拐点作为最适实验浓度。例如,本实验中的10μM。主要结论:(1)XN在无血清体系下诱导HL-60细胞发生ROS爆发,引起以细胞裂解为特征的急性坏死,这一过程的发生未涉及细胞凋亡、细胞焦亡或程序性细胞坏死这三种主要的程序性死亡方式。(2)鉴于血清掩盖细胞ROS生成的真实水平,在研究ROS生成的详细机制时,应在无血清条件下进行,并通过剂量依赖曲线选择ROS生成的拐点作为最适实验浓度。