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研究背景及目的:急性T淋巴细胞白血病(T cell Acute Lymphoblastic Leukemia,T-ALL)是一种恶性血液系统肿瘤,占儿童急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)病例的10-15%和成人ALL病例的20-25%。T-ALL的发生与发展是一个涉及细胞增殖以及侵袭与浸润的多步骤过程。目前越来越多的研究发现miRNA在T-ALL的发生发展中发挥重要作用。本课题旨在筛选T-ALL患者临床样本与对照样本间差异性表达最明显的miRNA,研究此miRNA在T-ALL中的生物学功能并筛选、鉴定其靶基因,深入探讨此miRNA靶基因在T-ALL中的作用及机制。研究内容和方法:利用生物信息学方法筛选GEO数据集中T-ALL与对照样本间差异性表达的miRNA(miR-146b-5p),并进一步采用实时荧光定量PCR检测miR-146b-5p在T-ALL患者及T-ALL细胞系中的表达水平。在线miRNA靶基因网站(miRanda、miRWalk 和 Targetscan)预测 miR-146b-5p 的潜在靶基因,GeneAnalytics 分析miR-146b-5p潜在靶基因的生物学功能,并分别通过细胞增殖、凋亡、周期、迁移与侵袭实验验证miR-146b-5p的生物学功能。为了进一步缩小靶基因的预测范围,本研究采用四个miRNA靶基因网站(miRanda、miRWalk、Targetscan和 miRDB)预测 miR-146b-5p 的潜在靶基因,并采用实时荧光定量PCR、Western Blot及双荧光素酶报告基因实验进一步验证miR-146b-5p的靶基因IL-17A,通过细胞增殖及Transwell实验探究miR-146b-5p的靶基因IL-17A在T-ALL中的作用,悬液芯片检测T-ALL细胞系中IL-17A的表达水平,实时荧光定量PCR和ELISA分别检测T-ALL患者外周血细胞和血清中IL-17A的表达水平,普通RT-PCR和流式细胞术检测T-ALL细胞系和患者中外周血细胞IL-17RA的表达水平。GSEA分析IL-17A在T-ALL中可能参与的生物学过程,实时荧光定量PCR筛选IL-17A介导的T-ALL转移相关分子,Western Blot实验进一步验证转移相关分子,STRING分析IL-17A可能涉及的信号通路,Western Blot实验验证IL-17A对NF-κB信号通路的激活作用,以及验证NF-κB信号通路对转移相关分子MMP9的表达水平的影响。动物实验验证IL-17A对T-ALL细胞系(MOLT-4)的侵袭与浸润能力的影响,流式细胞术检测小鼠外周血、肝和脾组织细胞中CD7阳性细胞的比例(MOLT-4细胞特异性分子标志),以及检测小鼠肝和脾组织细胞中髓系抑制性细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cell,MDSC)的细胞比例,从而验证 IL-17A对MOLT-4细胞的侵袭作用的影响。研究结果:生物信息学结果表明miR-146b-5p为T-ALL细胞(T-ALL患者外周血细胞及T-ALL细胞系)与正常对照者T细胞中的差异性表达miRNA,进一步实验发现T-ALL患者中miR-146b-5p表达水平较正常对照人群明显下降,GeneAnalytics结果显示miR-146b-5p靶基因与基因的转录调控密切相关,肿瘤细胞功能学实验结果表明过表达miR-146b-5p可抑制T-ALL细胞侵袭与浸润。四个在线靶基因预测网站预测到145个miR-146b-5p的靶基因,进一步验证发现IL-17A为miR-146b-5p的靶基因。T-ALL细胞可自分泌IL-17A,同时,T-ALL细胞表达其受体IL-17RA。抑制T-ALL细胞内源性IL-17A的分泌后,外源性IL-17A促进T-ALL细胞的侵袭与浸润能力。GSEA分析发现IL-17A主要通过金属内肽酶发挥促进T-ALL细胞侵袭与浸润的作用,STRING分析发现IL-17A与NF-κB1密切相关。当给予外源性IL-17A处理后,T-ALL细胞中NF-κB信号通路被激活,金属内肽酶相关分子MMP9表达上调,当给予NF-κB的抑制剂PDTC处理后,MMP9的表达水平显著下降。在小鼠尾静脉注射肿瘤细胞模型中,结果提示IL-17A-/-小鼠外周血和肝组织中CD7阳性细胞比例减少,而IL-17A-/-rescue组CD7阳性细胞比例增加,表明IL-17A促进MOLT-4细胞向肝脏侵袭。脾脏中各组CD7阳性细胞比例无明显变化;IL-17A-/-小鼠脾脏组织中MDSC细胞数量最低,提示IL-17A促进MDSC细胞在小鼠脾脏中浸润。结论:1.miR-146b-5p在T-ALL患者及T-ALL细胞系中低表达,过表达miR-146b-5p可抑制T-ALL细胞侵袭与浸润。2.IL-17A 为 miR-146b-5p 的靶基因。3.T-ALL细胞可自分泌IL-17A,同时表达IL-17RA。IL-17A与IL-17RA的相互作用可促进T-ALL细胞的侵袭与浸润。4.IL-17A通过NF-κB信号通路上调MMP9的表达,促进T-ALL细胞发生侵袭与浸润。5.体内实验证实IL-17A促进MOLT-4细胞向肝脏侵袭,IL-17A促进MDSC细胞在小鼠脾脏中浸润。