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背景及目的:大肠癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一,该疾病早期无症状,晚期有转移,对人类健康构成严重威胁。但针对大肠癌的各种治疗手段效果有限。因此,深入探讨大肠癌恶性行为的影响因素,有利于大肠癌新的治疗靶点的找寻。ADP核糖基化作为一种重要的翻译后修饰,目前对其的研究主要是通过对ADP核糖基化转移酶的研究实现的。关于ADP核糖基化修饰的具体靶点对肿瘤的影响,研究十分有限。在本课题组之前的研究中,观察到在分化程度比较低的大肠癌LoVo细胞中,组蛋白H3第117位精氨酸位点发生了单ADP核糖基化修饰,且此位点修饰与大肠癌侵袭能力的关系密切。上皮间质转化对肿瘤侵袭具有重要影响。本课题在先前研究的基础上,进一步研究组蛋白H3精氨酸单ADP核糖基化对大肠癌LoVo细胞上皮间质转化的影响,同时,应用转录组测序技术分析单ADP核糖基化修饰前后差异基因的表达情况,并通过生物信息学手段对差异表达基因进行功能分析和通路富集,探索组蛋白H3精氨酸单ADP核糖基化影响大肠癌细胞上皮间质转化的可能的分子机制。为大肠癌的临床治疗寻求新靶点提供一定的理论基础和实验依据。方法:本研究分为两部分:1.组蛋白H3精氨酸单ADP核糖基化对大肠癌LoVo细胞EMT的影响(1)实验分组:课题组先前已成功构建H3R117单ADP核糖基化修饰位点突变大肠癌LoVo细胞。对照组:未转染、慢病毒空载体转染大肠癌LoVo细胞;实验组:精氨酸突变为丙氨酸(H3R117A)、赖氨酸(H3R117K)的慢病毒载体转染大肠癌LoVo细胞。(2)采用Transwell实验检测各组大肠癌LoVo细胞的侵袭能力。(3)采用Western Blot检测大肠癌LoVo细胞上皮间质转化相关标志蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail的表达水平。(4)根据鬼笔环肽(Phalloidin)能与F-肌动蛋白(F-actin)特异性结合的原理,采用鬼笔环肽对大肠癌LoVo细胞进行免疫荧光染色,使用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架蛋白F-actin的变化。2.组蛋白H3精氨酸单ADP核糖基化影响EMT的分子机制(1)应用转录组测序技术筛选未转染LoVo细胞和H3R117A LoVo细胞之间的差异表达基因,并通过生物信息学分析对差异表达基因进行功能分析和通路富集。(2)通过KEGG通路富集分析,选择与EMT密切相关的糖胺聚糖-硫酸软骨素/硫酸皮肤素的生物合成通路中的关键基因,采用RT-qPCR方法进行验证。(3)采用Western Blot检测Wnt通路的关键因子β-catenin的表达水平。结果:1.组蛋白H3精氨酸单ADP核糖基化对大肠癌LoVo细胞EMT的影响(1)Transwell实验结果显示,与对照组相比,H3R117A LoVo细胞和H3R117K LoVo细胞的侵袭能力显著下降(P<0.05)。未转染LoVo细胞和转染空载体LoVo细胞之间无显著差异(P>0.05),H3R117A LoVo细胞和H3R117K LoVo细胞之间无显著差异(P>0.05)。(2)Western Blot结果显示,与对照组相比,H3R117A LoVo细胞和H3R117K LoVo细胞中N-cadherin、Vimentin、Snail表达水平下降(P<0.05),E-cadherin表达水平升高(P<0.05)。未转染LoVo细胞和转染空载体LoVo细胞之间无显著差异(P>0.05),H3R117A LoVo细胞和H3R117K LoVo细胞之间无显著差异(P>0.05)。(3)激光共聚焦显微镜观察结果显示,与对照组相比,H3R117A LoVo细胞和H3R117K LoVo细胞的细胞骨架蛋白F-actin荧光强度显著降低(P<0.05)。未转染LoVo细胞和转染空载体LoVo细胞之间无显著差异(P>0.05),H3R117A LoVo细胞和H3R117K LoVo细胞之间无显著差异(P>0.05)。2.组蛋白H3精氨酸单ADP核糖基化影响EMT的分子机制(1)应用转录组测序技术共识别出了58174个基因,其中2324个为具有统计学意义的差异表达基因(q-value<0.05,|fold change|>2)。GO功能分析显示,这些差异表达基因在代谢过程、细胞器、结合和催化活性等功能中显著富集;KOG功能分析显示,差异表达基因在染色质结构和动力学中富集程度最为显著;KEGG通路富集分析结果显示,富集最显著的一条通路为糖胺聚糖-硫酸软骨素/硫酸皮肤素的生物合成通路。(2)在糖胺聚糖-硫酸软骨素/硫酸皮肤素的生物合成通路中,共有7个差异表达基因富集到该通路,选择差异倍数最显著的3个基因进行RT-q PCR实验验证,分别是B3GALT6、CHST12、CHST15。与未转染L oVo细胞相比,H3R117A LoVo细胞中B3GALT6和CHST12表达水平升高,CHST15表达水平下降。RT-qPCR结果显示,基因表达的变化趋势与测序结果一致。(3)Western Blot结果显示,与未转染LoVo细胞相比,H3R117A LoVo细胞中,β-catenin的表达水平显著降低(P<0.05)。结论:组蛋白H3精氨酸单ADP核糖基化可以影响大肠癌LoVo细胞的上皮间质转化,进而通过上皮间质转化影响大肠癌细胞的侵袭能力。其机制可能与组蛋白H3精氨酸单ADP核糖基化影响糖胺聚糖合成相关酶B3GALT6、CHST12和CHST15基因表达,并影响Wnt通路关键因子β-catenin表达有关。详尽机制有待进一步研究。