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本研究以Chk-1和PARP-1为作用靶点,构建其RNAi表达载体,干扰细胞损伤修复机制,观察其辐射增敏作用,拟提高肿瘤治疗的敏感性,探索一种有效的肿瘤治疗途径。结果显示1.对经限制性内切酶酶切鉴定正确的Chk-1和PARP-1重组RNAi载体进行测序,结果与理论序列完全一致。然后以脂质体介导分别转染Lewis肺癌细胞株筛选出有效的Chk-1和PARP-1 RNA i载体,即pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536、pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308。2. 2Gy照射+ Chk-1、PARP-1 siRNA组的吸光度值与2Gy照射组、Chk-1和PARP-1 siRNA组比较差异有显著意义(p<0.05)。RT-PCR和免疫组化检测结果显示转染细胞Chk-1、PARP-1表达水平降低。Chk-1和PARP-1 siRNA转染、2Gy照射可诱导细胞凋亡,与正常对照组比,差异显著(p<0.05),并且siRNA转染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌细胞凋亡(p<0.05)。3.pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536、pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308联合照射组分别与各自联合照射组比,Lewis肺癌细胞的吸光度值有显著差异(p<0.05)。2Gy照射组+ pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536+ pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308组对Lewis肺癌细胞的抑制率最高。表明Chk-1和PARP-1 RNAi对肿瘤有治疗作用,与放疗有协同作用;pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536和pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308有协同作用。4.2Gy照射组与假照组和pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536组、pGPU6/GFP/Neo- PARP-1-1308组、pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536+ pGPU6/GFP/Neo- PARP-1-1308组比,肿瘤生长缓慢(p<0.05);联合Chk-1和PARP-1的siRNA治疗,与单纯照射组及单纯siRNA治疗组比,肿瘤生长缓慢(p<0.05)。pGPU6/GFP/ Neo-PARP-1-1308和pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536联合放疗,与各自分别联合放疗比,肿瘤明显生长缓慢(p<0.05)。表明pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308、pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536对肿瘤与放疗有协同作用,pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536与pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308有协同作用,pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536与pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308联合治疗具有辐射增敏作用。5.镜下观察各组Lewis肺癌小鼠瘤组织的形态学变化。对照组癌细胞成片状分布,细胞生长旺盛,细胞核浓染,癌细胞几乎不见坏死。放射组癌组织内存在一些异常的肿瘤细胞,这些细胞呈小的巢状分布于正常的肿瘤细胞之间;细胞核、固缩、坏死;坏死的肿瘤细胞较对照组明显增多。Chk-1或PARP-1+放疗组癌组织存在大量异常的肿瘤细胞,这些细胞呈片状分布;细胞核染色较轻、固缩、坏死,部分细胞崩解;坏死的肿瘤细胞较其他组均明显增多。Chk-1和PARP-1联合放疗组癌组织细胞核固缩、坏死,坏死的肿瘤细胞较各自单独与放疗联合组均明显增多。6.激光共聚焦显微镜下观察发现,肿瘤局部照射后2天,Chk-1及PARP-1 siRNA表达载体即散在分布于小鼠肿瘤组织内。7.与2Gy照射组,pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536和pGPU6/GFP/Neo-PARP-1- 1308分别联合放疗可使肿瘤组织表达的Bcl2下调、Bax上调;pGPU6/GFP/Neo- Chk-1-536和pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308联合放疗可明显下调肿瘤组织表达的Bcl2、上调Bax,表明siRNA与照射具有协同作用。8.与假照射组比,Chk-1和PARP-1的siRNA分别使肿瘤细胞的Chk-1和PARP-1 mRNA表达下调;2Gy照射后,应用siRNA治疗,与单纯照射组, Chk-1、PARP-1 mRNA表达量下降,但与未照射、单纯siRNA治疗组比下降不明显,表明siRNA与照射具有协同作用。pGPU6/GFP/Neo-Chk-1-536和pGPU6/GFP/Neo- PARP-1-1308有协同作用,联合治疗增加辐射敏感性。结论成功构建并筛选Chk-1、PARP-1的RNAi载体,针对Chk-1、PARP-1的RNAi可以阻断肿瘤细胞DNA损伤修复,引起细胞凋亡,从而提高放疗对肿瘤的抑制率,证实Chk-1、PARP-1 RNAi具有放疗增敏作用。