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乳腺癌已成为威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤之一。目前，乳腺癌的主要治疗手段包括：手术、化疗、放疗、内分泌治疗以及靶向治疗，后4种治疗手段通常统称乳腺癌的辅助治疗，一般要根据ER、PR、HER2的表达状况来制定辅助治疗策略。三阴乳腺癌因自身特殊的分子特点而无法采用内分泌治疗和分子靶向治疗，化疗成为其主要的治疗手段，但容易复发。迷迭香酸(Rosmarinic Acid，RA)是迷迭香等多种传统中药的有效成分，前期研究发现其对肝癌具有一定抗肿瘤作用，本课题组以左旋多巴为底物合成了一系列迷迭香酸类似物，本课题拟研究迷迭香酸类似物-5（RAA5，Rosmarinic Acid Analogue-5）对三阴乳腺癌抗肿瘤活性。 目的： 1.探讨迷迭香酸类似物RAA5对几种常见肿瘤细胞的增殖抑制效果; 2.重点探讨RAA5对人源三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞的细胞生物学效应; 3.阐明RAA5对人源三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞诱导凋亡的可能机制。 4.明确RAA5对鼠源三阴乳腺癌4T1细胞在动物体内的抗肿瘤效应以及可能机制。 方法： 1、细胞体外实验：①常规培养肿瘤细胞MDA-MB-231、MCF-7、MCF-7/ADR和HT29，采用MTT法检测RAA5对这几种肿瘤细胞的增殖的影响。②针对人源三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞，采用平板克隆实验测定RAA5对细胞长期增殖的影响，采用Hoechst33258染色法观察RAA5对凋亡细胞形态学的影响，采用划痕实验法检测RAA5对细胞迁移能力的影响。采用流式细胞仪定量检测RAA5诱导MDA-MB-231细胞凋亡情况。RT-PCR检测不同浓度RAA5对EGFR mRNA表达的影响，免疫印迹法检测RAA5对EGFR蛋白及其下游的MAPK通路和AKT/NF-κB通路相关蛋白的影响。 2、动物体内实验：皮下注射鼠源三阴乳腺癌细胞4T1建立BALB/c小鼠荷瘤模型，观察RAA5干预的抗肿瘤效果和肝肾毒性，免疫印迹法检测RAA5对EGFR及其下游的MAPK通路和AKT/NF-κB通路相关蛋白的影响。 结果： 1、细胞体外实验：①MTT结果显示RAA5显著抑制MDA-MB-231，MCF-7，MCF-7/ADR和HT29四种细胞的增殖。②Hoechst33258染色结果显示，RAA5明显诱导细胞的凋亡。③划痕实验结果显示，RAA5抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力。④流式细胞分析结果显示，RAA5能诱导细胞凋亡。⑤RT-PCR结果显示，EGFR mRNA水平随RAA5浓度增加而降低。⑥Western Blot结果显示，Bax和Caspase-3蛋白表达量随RAA5浓度的递升而增加，而Bcl-2蛋白表达量则减少。⑦针对EGF/MMAPK通路，随着RAA5浓度增加，Western Blot结果显示抑制MAPK通路。应用胰岛素(100μg/L，36h)激活MAPK通路，但当加入RAA5（100μmol/L，36h）之后，p38/MAPK、ERK/MAPK通路和JNK/MAPK通路均受到不同程度的影响。应用PD153035阻断EGFR，并加入RAA5（100μmol/L，36h）干预，仍然能发挥RAA5的诱导凋亡作用。⑧针对AKT/NF-κB通路，随着RAA5浓度的升高，AKT、p-AKT和p65蛋白的表达显著下降;应用胰岛素(100μg/L，36h)激活AKT/NF-κB通路，加入RAA5(100μmol/L)后，通路蛋白表达明显受抑制。 2、在体内，①皮下注射鼠源三阴乳腺癌4T1细胞成功建立BALB/c小鼠荷瘤模型，经RAA5或CTX干预后，各个治疗组的瘤体均较模型组缩小，以CTX组和高剂量组最明显。②H&E染色结果显示，与模型组比较，CTX组和各RAA5给药组细胞坏死程度减小、肿瘤组织松散程度减轻，肿瘤细胞数量减少，肿瘤细胞密度降低，并以CTX组和高剂量组明显（P＜0.05）。③CTX或RAA5干预前、后，荷瘤小鼠体重变化无统计学意义(P＞0.05)。与模型组相比，CTX组和RAA5各剂量组移植瘤重量均显著下降(P＜0.05)，下降幅度以CTX组和高剂量RAA5组最明显(P＜0.01)。④与正常对照组相比，实验各组的小鼠脾脏均明显普遍性增大，实验各组的肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数均明显高于正常对照组(P＜0.001)，但与模型组相比，CTX组和RAA5各剂量组的脏器指数间无统计学差异(P＞0.05)。⑤肝脏病理学HE染色结果显示，正常对照组和实验各组小鼠的肝脏均未见明显的片状肝细胞坏死表现。实验各组的小鼠肝肾功能与正常对照组相比也未出现明显损害表现。⑥移植瘤组织蛋白的免疫印迹检测，结果显示，与模型组相比，CTX和高剂量RAA5促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的蛋白表达明显增加，Bcl-2蛋白表达明显减少。CTX和RAA5各剂量组均可抑制EGFR蛋白的表达，以CTX和高剂量RAA5最显著。 结论： 1.RAA5显著抑制MDA-MB-231，MCF-7，MCF-7/ADR和HT29的增殖，抑制三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力。 2.RAA5明显诱导MDA-MB-231细胞凋亡，具有抗肿瘤作用的生物学基础。 3.RAA5诱导MDA-MB-231细胞凋亡过程可能与MAPK各条通路的信号传递有关。 4.EGFR是RAA5功能发挥的其中一个作用靶点，RAA5可能是多靶点作用的候选药物。 5.应用鼠源三阴乳腺癌4T1细胞在BALB/c小鼠成功建立荷瘤模型，RAA5短期给药安全。 6.在小鼠体内，RAA5对鼠源三阴乳腺癌4T1具有明显的抗肿瘤效应。EGFR及其下游的MAPK通路和AKT/NF-κB通路可能介导RAA5诱导凋亡的抗肿瘤作用，但后者还需要更多依据来证实。