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肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)是一种重要的食源性致病菌,其感染会造成出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征等严重并发症,带来严重的临床危害[1-3]。EHEC感染在世界范围内流行,具有较高的病死率[4]。2011年在德国等大多数欧洲国家爆发的致死性E.coli感染,造成了巨大的社会恐慌和经济损失。病原菌与宿主的相互作用是决定其感染、发病和预后的关键[5]。当EHEC侵染真核细胞时,宿主会启动各种固有和获得性免疫应答反应,二者相互对抗,最终决定了 EHEC是成功定植破坏宿主机能还是被宿主所清除。在EHEC与宿主免疫系统相互作用过程中,会启动多种细胞信号通路的应答反应,如细胞内炎症通路的启动(典型的第一炎症信号NF-κB通路的快速应答)。许多科学家聚焦于炎症通路反应,引发了新的感染免疫研究热点。其中有两个研究团队分别关注了 EHEC感染时与宿主发生相互作用的两个效应因子NleC和NleH,他们的研究发现:两个毒力因子会通过抑制NF-κB炎症通路,有利于EHEC感染初期的定植和后续的侵染扩散,它们的基因定位于基因组前噬菌体上[6,7]。EHEC前噬菌体作为一个可移动遗传元件,是菌体获得新毒力因子的重要来源。致死性志贺毒素(Stx)基因就位于此前噬菌体上[8]。针对EHEC的主要血清型O157:H7,其全基因组序列测序已完成,扫描全基因组序列分析后,一段位于志贺毒素编码区上游生物信息学预测为编码丝苏氨酸蛋白激酶的编码基因引起我们的关注,将其暂命名为Nlep。查阅关于此基因的现有文献报道发现其编码的蛋白证实具有磷酸化激酶活性,可以在前噬菌体对抗外源噬菌体时提供一种选择优势[9,10]。磷酸化作用对于信号通路的开启和关闭具有重要的调控作用,而位于EHEC前噬菌体上的Nlep是否参与病原菌的感染过程,并且是否直接参与与宿主的相互作用以及可能的作用机制如何?为了探讨这些科学问题,本论文分两个部分开展实验研究:第一部分:Nlep作为毒力因子参与了 EHEC细菌感染通过实验研究,分别证实:1.在细菌感染时Nlep通过Ⅲ型分泌系统进入宿主细胞。EHEC细菌感染Hela细胞后,特异抗体荧光定位发现Nlep在感染时进入宿主细胞质中;β-内酰胺酶报告系统检测发现当敲除EHEC Ⅲ型分泌系统关键蛋白EspN后,Nlep则无法进入细胞。以上结果表明EHEC感染初期Nlep可以通过Ⅲ型分泌系统进入到细胞质中。2.EHEC感染时Nlep促进宿主炎症因子分泌。首先我们在EHEC感染的细胞裂解液中进行36种细胞因子的检测,发现炎症因子IL-8和IL-1β表达水平显著提高。随后在EHEC感染的结肠上皮细胞系和巨噬细胞系中,人IL-8 ELISA快速检测结果发现Nlep均能促进炎症因子IL-8高表达,而缺失突变Nlep会对IL-8的表达水平有显著降低作用(P<0.01),说明Nlep对于感染后炎症因子的表达是一个关键性调控因子。3.Nlep加剧EHEC感染小鼠的炎症反应。当EHEC感染小鼠后,Nlep有利于菌体的定植;而且随感染天数递增,Nlep促进小鼠血液中炎症因子IL-8的分泌;到感染后期,发生小鼠的死亡,且Nlep野生株组和缺失突变株组存活率具有显著差异(0/20 vs 5/20),缺失突变株组感染死亡率下降;同时病理报告显示小鼠肠道和脾发生典型的炎症损伤。表明在EHEC感染过程中Nlep与小鼠炎症反应以及所导致的致死性损伤密切相关。以上结果提示:Nlep是病原菌一个重要的Ⅲ型分泌系统毒力因子,在EHEC感染过程中可侵入宿主细胞,显著上调IL-8等炎症因子的表达,在病原菌致病性方面发挥重要作用。第二部分:Nlep作用于炎症反应第一信号NF-κB通路的分子机制在分子、细胞水平确证Nlep对宿主炎症反应第一信号NF-κB通路的作用,并阐明分子机制:1.Nlep作用于NF-κB信号通路。无论在细菌感染还是细胞转染水平,Nlep都能非常有效地促进NF-κB通路抑制因子IkBα的磷酸化,介导入核因子p65入核转移,激活NF-κB炎症反应。2.Nlep对NF-κB通路抑制因子IκBα的磷酸化作用。体外酶活实验和质谱实验证实,磷酸激酶Nlep存在丝/苏氨酸激酶与酪氨酸激酶两种形式,对底物IkBα的磷酸化位点不仅有常见的丝氨酸(Ser32/36)位点而且有新的酪氨酸(Tyr28/55)位点。3.Nlep磷酸化IκBα不依赖于通路上游IKK复合物。RNA干扰实验发现磷酸激酶Nlep对靶分子IkBα的磷酸化作用是独特的,并不依赖于IkBα在通路上游的IKK复合物的辅助,即磷酸激酶Nlep可独立地激活NF-κB信号通路。4.Nlep在NF-κB非经典途径中的作用。免疫印迹和干扰实验发现磷酸激酶Nlep也可独立地经非经典途径激活NF-κB信号通路,同样不需要IKK复合物的辅助。以上结果提示:毒力因子Nlep是NF-κB炎症通路的强激活因子,它可以通过磷酸化靶分子IkBα的丝氨酸(Ser32/36)及酪氨酸(Tyr28/55)和或p100来独立的通过经典与非经典途径激活宿主细胞的NF-κB通路。综合全文得出结论:EHEC感染宿主后,毒力因子Nlep通过Ⅲ型分泌系统介导侵入宿主细胞,做为丝/苏氨酸激酶与酪氨酸激酶,促进NF-κB通路抑制因子IkBα的磷酸化,介导入核因子p65入核转移,不依赖上游IKK复合物独立激活NF-κB炎症通路,显著上调IL-8等炎症因子的表达,进一步反馈调节信号通路,从而加剧感染。本论文的研究结果也提示很有可能存在其他通路的协调作用,为今后研究工作的深入打下了重要基础。