研究背景：近年来,随着生物材料的发展,口腔颌面部软组织填充术也得到了迅速的发展。软组织填充术因为能用于解决口腔颌面部组织凹陷、不对称等问题而广泛应用于临床,寻找一种理想的软组织填充材料具有重要的临床意义。面部软组织填充材料的应用已成为国内外学者研究的一项热门课题。目前的软组织填充材料有多种多样,在美容外科领域的软组织填充材料也不断有新的发展。在众多的材料中,可注射型的填充材料因为其微创、操作简便等特点更倍受青睐,是未来研究发展的方向。脱细胞真皮基质作为近年来国内外新兴起的一种组织替代物,是通过各种脱细胞技术处理后获得的异种基质材料或者异体基质材料,去除了材料的细胞抗原免疫活性但却保留着正常胶原的三维结构和真皮中含胶原支架的细胞外基质,能为组织细胞的再生提供一个良好的支架。脱细胞真皮基质最开始被应用于烧伤整形外科及口腔颌面外科治疗中,表现出了良好的临床效果。基于材料良好的生物相容性,国内外有学者开始尝试将脱细胞真皮基质作为软组织填充材料应用于美容外科中,以修复口腔颌面部的软组织缺损、唇部美容、眼周部填充、鼻唇沟填充等。因此,本课题组通过初步颗粒化片状脱细胞真皮基质后,分别将颗粒状脱细胞真皮基质、片状脱细胞真皮基质和透明质酸钠凝胶作为软组织填充材料,在动物体内建立软组织增量模型,探究颗粒状脱细胞真皮基质与片状脱细胞真皮基质的组织增量效果和转归机制,为进一步细化颗粒状脱细胞真皮基质乃至制成注射型的脱细胞真皮基质打下基础,以期为临床提供更理想的软组织填充材料。目的：本实验将颗粒状脱细胞真皮基质、片状脱细胞真皮基质和透明质酸钠凝胶作为软组织填充材料,通过在动物体内建立软组织增量模型,从组织增量的体积和高度来初步探究3种不同材料的组织增量效果；初步研究填充材料的转归机制;以探讨进一步细化颗粒状脱细胞真皮基质乃至制成注射型的脱细胞真皮基质的可行性。方法：1.在兔耳上分别注射透明质酸钠凝胶0.05 ml、0.10 ml、0.15 ml,每组6个样本,用三维轮廓扫描仪扫描建模后测量注射区软组织增量的体积；在-20℃环境中使用OCT包埋剂包埋标本,切片直至达到兔耳注射区最高点,并在注射区的矢状剖面上使用游标卡尺测量记录注射区域组织的高度。2.大小约1.0cm×1.0cm×1mm的片状脱细胞真皮基质(海奥口腔修复膜)修剪成1mm×1mm×1mm大小的颗粒状,在兔耳移植区域作一长约1.0 cm的横行切口,在兔耳表皮与软骨之间潜行分离出一个大小约为1.0 cm×1.0cm的皮下袋,在兔耳上移植经生理盐水液化的颗粒状脱细胞真皮基质、片状脱细胞真皮基质,记录为颗粒状脱细胞真皮基质组和片状脱细胞组真皮基质组,分别在移植后1周、2周、1月、3月、6月、9月收获标本,每组每个时间段6个样本；在兔耳上注射透明质酸钠凝胶(润百颜)0.10ml,记录为透明质酸钠凝胶组,在术后的1周、2周、1月、3月、6月收获标本,透明质酸钠凝胶组每个时间段6个样本；在6只兔耳中选择6个空白区域,作为空白组。3个处理组的所有兔耳标本采用三维轮廓扫描仪扫描建模后测量移植区软组织增量的体积。3个处理组每个时间点随机选择4个标本进行Micro-CT扫描,进行三维重建后测量移植区软组织增量的体积。使用SPSS20.0统计分析软件比较分析不同处理组(颗粒状脱细胞真皮组、片状脱细胞真皮基质组和透明质酸钠凝胶组)在移植后不同时间段移植区域软组织增量体积。3.在兔耳上获得的所有标本采用4%多聚甲醛液固定,EDTA脱钙液脱钙后常规脱水包埋、切片,行HE染色、Masson染色、天狼星红染色。HE染色切片在普通光学显微镜下观察移植区域的组织形态并使用Image-pro plus 6.0测量移植区域的组织高度。天狼星红染色切片在偏振光显微镜下观察胶原分布情况,并使用Image-pro plus 6.0分析测量移植区域Ⅰ/Ⅲ型胶原比例(红色和绿色在同一图片中所占面积的比值)。结果：1.注射量0.05 ml、0.10 ml.0.15 ml的样本软组织增量体积分别为(57.277±9.772) mm3、(106.785±10.568) mm3、(129.686±28.896) mm3,3组注射区域的组织增量分别与各自的注射量体积相互比较,差异均无统计学意义(P=0.128>0.05；P=0.177>0.05；P=0.146>0.05)。移植区域组织高度分别为(2.300±0.182) mm、(2.797±0.279) mm、(2.890±0.411) mm.0.05 ml组的组织高度低于0.10 ml组和0.15ml组(P=0.001<0.05；P=0.000<0.05),注射量由0.05 ml增加到0.10ml时,组织高度随注射量的增加而增加：0.10ml组与0.15ml组相互比较,显示组织增量的高度差异无统计学意义(P=-0.441>0.05),提示注射量由0.10ml增加到0.15ml时,组织增量高度并没有发生明显变化。2.颗粒状、片状脱细胞真皮基质组和透明质酸钠凝胶组在各个时间段的兔耳移植术区均未见明显感染、坏死,各个实验动物术后一般情况良好,饮食、排便等活动正常,未见明显不适。颗粒状脱细胞真皮基质移植组、片状脱细胞真皮基质移植组在术后9月移植区域软组织增量效果不明显,三维轮廓扫描仪和Micro-CT扫描仪无法获得该区域软组织增量。三维轮廓扫描仪和Micro-CT扫描仪两种不同的测量手段得到的各处理组在1周、2周、1月、3月、6月组织增量体积结果基本一致,3种填充材料均具有组织增量效果。在总体上看,随着移植时间增加,颗粒状脱细胞真皮基质、片状脱细胞真皮基质和透明质酸钠凝胶组移植区域的组织增量体积呈递减趋势,且在最初的1个月内递减速度较快,3～6个月期间递减趋缓。颗粒状脱细胞真皮基质组与片状脱细胞真皮基质组的组织增量体积均值在移植术后的各个时间点相接近；透明质酸钠凝胶组的组织增量体积均值在各个时间点均小于颗粒状脱细胞真皮基质组。组织增量体积统计学分析结果：三维轮廓扫描仪和Micro-CT扫描仪测量所得的组织体积结果分别经过析因方差分析,都只需分别分析不同时间和不同移植处理手段的主效应,不需分析两者交互效应。同一处理因素不同水平之间以及同一水平不同处理因素之间的比较使用单因素方差分析。进行后续性两两比较方差齐时使用LSD检验,方差不齐时使用Tamhane检验。在3个处理组中,6月移植区域组织体积分别与各自处理组中1周、2周、1月、3月的组织体积作进一步两两比较。三维轮廓扫描仪测量和Micro-CT扫描仪测量结果分析,在透明质酸钠凝胶组中(P=0.005<0.05,P=0.042<0.05),6月与3月移植区域组织体积的差异有统计学意义；在颗粒状脱细胞真皮基质组中(P=0.415>0.05,P=0.227>0.05)和在片状脱细胞真皮基质组中(P=0.186>0.05,P=0.170>0.05),6月与3月移植区域组织体积的差异均没有统计学意义。同一水平不同处理因素之间单因素方差分析。三维轮廓扫描仪测量和Micro-CT扫描仪测量结果分析,在移植后2周,颗粒状脱细胞真皮基质组(P=0.002<0.05；P=0.005<0.05)、片状脱细胞真皮基质组(P=0.001<0.05；P=0.012<0.05)的组织增量体积均大于透明质酸钠凝胶组。3.HE染色结果：在移植后的1周和2周,颗粒状脱细胞真皮基质组、片状脱细胞真皮基质组和透明质酸钠凝胶组中大量的红细胞和炎症细胞浸润,有功能活跃的成纤维细胞长入移植区域内。在移植后期颗粒状脱细胞真皮基质组和片状脱细胞真皮基质组中原有的填充材料随着时间逐渐吸收完全,移植区域组织改建成与宿主周围组织一致的结构。在透明质酸钠凝胶组中,填充材料和新生的纤维形成暂时的支架,供细胞爬行生长,随着时间延长,支架结构逐渐崩解。Masson染色结果：颗粒状脱细胞真皮基质组、片状脱细胞真皮基质和透明质酸钠凝胶组在移植区域均可见新生纤维长入,并且随着移植时间的推移,纤维数量增加。在颗粒状脱细胞真皮基质组和片状脱细胞真皮基质组中,新生的纤维主要是逐渐包绕、替代填充物,早期的纤维排列较为紊乱,后期纤维排列结构整齐、致密；在透明质酸钠凝胶组,新生的纤维长入,形成支架供细胞爬行生长,随着时间推移,纤维支架结构逐渐崩解。天狼星红染色结果：偏振光显微镜下,Ⅰ型胶原纤维呈红色、橙黄色或黄色；Ⅲ型胶原纤维呈绿色,非胶原纤维处呈黑色。各个处理组切片视野中红黄色面积与绿色面积随着时间发生规律性变化。颗粒状脱细胞真皮基质组,在移植术后的早期,绿色的Ⅲ型胶原纤维逐渐增多,Ⅲ型胶原纤维主要分布在填充材料的颗粒与颗粒之间,从微粒四周向中央长入,随后Ⅲ型胶原纤维开始减少,红色的Ⅰ型胶原纤维数量增多,在6月和9月时移植区域内红色的Ⅰ型胶原纤维为主要的胶原纤维,胶原纤维与兔耳周围组织的纤维排列方式相似。在片状脱细胞真皮基质组,在移植术后的早期,绿色的Ⅲ型胶原纤维最开始主要分布于片状填充材料的外周,在填充材料的兔耳移植区域剥离的基底面向表皮面长入,随着时间的推移,绿色的Ⅲ型胶原纤维逐渐被红色的Ⅰ型胶原纤维所替代。透明质酸钠凝胶组,在早期,新生的绿色Ⅲ型胶原纤维形成网状结构,移植时间延长,红色的Ⅰ型胶原纤维从网状结构的四周向中央逐渐增多,替代绿色的Ⅲ型胶原纤维。Ⅰ/Ⅲ型胶原比例变化结果：3种填充材料Ⅰ/Ⅲ型胶原比例在移植术后呈先下降后上升的趋势,在移植术后2周Ⅰ/Ⅲ型胶原比例出现了最低点,在6月和9月Ⅰ/Ⅲ型胶原比例基本趋于稳定,与正常的兔耳组织Ⅰ/Ⅲ型胶原比例相接近。移植区域胶原亚型在不同时间的规律变化符合机体创伤愈合胶原变化过程。Ⅰ/Ⅲ型胶原比例比较的统计学结果：在6月,颗粒状脱细胞真皮基质组(P=0.455>0.05),片状脱细胞真皮基质组(P=0.688>0.05),透明质酸钠凝胶组(P=0.339>0.05),与空白组Ⅰ/Ⅲ型胶原比例比较,差异无统计学意义。在移植术后的9月,颗粒状脱细胞真皮基质组(P=0.330>0.05),片状脱细胞真皮基质组(P=0.148>0.05),与空白组Ⅰ/Ⅲ型胶原比例比较,差异无统计学意义。移植区域组织高度结果：从总体上看,颗粒状脱细胞真皮基质组、片状脱细胞真皮基质组和透明质酸钠凝胶组移植区域组织高度呈递减趋势,在最初的1个月内递减速度较快,随后高度变化趋缓,在6月、9月时组织高度逐渐与空白组接近。与移植区域组织增量体积不同,在经历了高度变化较大的移植早期(1个月)后,透明质酸钠凝胶组移植区域组织高度均值高于颗粒状脱细胞真皮基质组和片状脱细胞真皮基质。在移植术后的6月,片状脱细胞真皮基质组(P=0.056>0.05),与空白组兔耳软骨上组织的厚度比较,差异无统计学意义。在移植术后的9月,颗粒状脱细胞真皮基质组(P=-0.790>0.05),片状脱细胞真皮基质组(P=0.776>0.05),与空白组Ⅰ/Ⅲ型胶原比例比兔耳软骨上组织的厚度比较,差异无统计学意义。结论：1.应用兔耳作为注射型软组织填充材料研究动物模型时,0.05-0.10 ml是一个适当的注射量范围。2.颗粒状脱细胞真皮基质、片状脱细胞真皮基质和透明质酸钠凝胶作为软组织填充材料时,从移植区域组织的增量体积和高度来评价材料组织增量效果的显著性和稳定性时,3组材料均具有良好的组织增量效果。片状脱细胞真皮基质通过初步颗粒化,制作成大小约为1 mm×1 mm×1 mm的颗粒状时,在移植术后的9个月内,颗粒状脱细胞真皮基质的组织增量效果能够取得与片状脱细胞真皮基质移植相似的增量效果；在移植术后组织增量体积的稳定性方面优于透明质酸钠凝胶。进一步细化颗粒状脱细胞真皮基质乃至制成注射型的脱细胞真皮基质,以期制作出更为理想的填充材料具有一定的可行性。3.颗粒状脱细胞真皮基质、片状脱细胞真皮基质作为填充材料移植于兔耳后,根据组织学上的变化,提示脱细胞真皮基质无论是通过片状还是制作成1mm×1mm×1mm的颗粒状植入,脱细胞真皮基质在被逐渐吸收的同时,宿主的新生纤维组织通过不同的方向长入、替代原有的填充材料,新生的胶原纤维成分逐渐成熟,排列结构变得整齐致密,最终移植区域组织都改建成与宿主周围组织相一致的结构。