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多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是浆细胞恶性增殖性疾病,发病率在血液系统恶性肿瘤中位居第二位,近年来在我国发病率呈逐年上升趋势。MM发病机制复杂,研究发现血液系统肿瘤的生物学行为同实体肿瘤一样受到血管生成的影响,并且在MM疾病发展过程中,病理性血管生成对MM起促进作用。骨髓瘤血管生成过程中内皮细胞处于核心位置,参与血管腔的改建,新生和稳定等全部过程,是骨髓瘤新生血管扩张的关键因素。研究发现,Rho(Ras homologous)家族成员RhoC,通过调节细胞骨架参与肿瘤血管的形成,对多发性骨髓瘤浸润转移发挥重要作用。前期研究中发现RhoC不仅在MM细胞表达,同样表达于骨髓瘤内皮细胞(multiple myeloma vein endothelial cells,MVECs)和正常人脐静脉内皮细胞(normal human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中,推测下调 RhoC在MVECs中的表达会减少骨髓瘤血管生成,且RhoC可直接参与MM血管内皮细胞的形态或功能调节。关于下调MM细胞内RhoC表达体内对血管生成的影响,以及下调MVECs中RhoC表达对MM细胞是否存在影响还需进一步研究。本课题分为两部分展开研究。第一部分采用慢病毒包装RhoC shRNA转染MVECs和HUVECs,并收集转染后各组内皮细胞培养基条件培养PMI8226细胞;qRT-PCR 和 Western blot 检测各组 PMI8226 细胞 RhoC mRNA 和蛋白表达;CCK-8法、transwell侵袭实验、流式细胞技术分别检测各组RPMI8226细胞增殖、侵袭能力和细胞周期变化;Western blot 检测 PI3K、CDK、CyclinD1、MMP2 及 MMP9等蛋白表达。通过以上实验:观察下调MVECs中RhoC表达对PMI8226细胞的生物学行为是否产生影响,并探讨下调MVECs内RhoC表达影响骨髓瘤RPMI8226细胞增殖、侵袭能力及细胞周期变化的可能机制。MM新生血管生成是一个涉及多步骤多因素的复杂过程。前期研究揭示了RhoC在MVECs生理活动中发挥重要作用,但下调PMI8226细胞中RhoC的表达,体内对新生血管的影响尚不明确。因此在第二部分,构建MM移植瘤模型,记录MM移植瘤生长;免疫组化方法检测Ki-67在MM移植瘤中表达;计数MM移植瘤内微血管密度(microvascular density,MVD);计数Matrigel内由VEGF诱导的MM移植瘤内新生血管数及血管长度。探讨下调PMI8226细胞内RhoC表达对PMI8226细胞增殖,MM移植瘤生长和MM移植瘤内血管新生的影响,以期为探索临床治疗MM的新方法提供理论依据。第一部分下调MVECs中RhoC表达对MM细胞生物学行为的影响1 材料和方法1.1 骨髓瘤血管内皮细胞的诱导和鉴定骨髓瘤细胞上清液作为条件培养基诱导HUVECs细胞获得MVECs。鉴定方法:①CCK-8检测细胞增殖;②transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞迁移、侵袭能力;③qRT-PCR检测肿瘤血管内皮细胞特异标志物TEM1、TEM8的表达;④ELISA检测肿瘤内皮细胞内VEGFA的表达含量。通过上述方法检测诱导后内皮细胞是否具有肿瘤内皮细胞特性。1.2 RhoC shRNA转染MM血管内皮细胞对RPMI8226细胞生物学行为的影响(1)细胞的分组培养根据前期研究基础,选用慢病毒包装的RhoC shRNA-3、RhoC shRNA-NC质粒,转染HUVECs和MVECs,荧光显微镜下评价转染效果。分别培养转染后各组HUVECs和MVECs 48h后收取上清,作为条件培养基诱导RPMI8226细胞,RPMI8226细胞分组培养如下:MVEC-S培养组:转染RhoC shRNA后MVECs上清液作为条件培养基培养RPMI8226细胞;MVEC-NC培养组:转染RhoC shRNA-NC后MVECs上清液条件培养RPMI8226细胞;HUVEC-S培养组:转染RhoC shRNA后HUVECs上清液条件培养RPMI8226细胞;HUVEC-NC培养组:转染RhoC shRNA-NC后HUVECs上清液条件培养RPMI8226细胞。(2)观察下调MVECs中RhoC表达对MM细胞生物学行为的影响及可能机制采用 qRT-PCR 和 Werstern blot 检测各组 RPMI8226 细胞中的 RhoC mRNA和蛋白表达;采用流式细胞术、transwell侵袭实验分别检测各组RPMI8226细胞的细胞周期和侵袭能力;采用Werstern blot检测各组RPMI8226细胞中的PI3K、Akt、CDK、CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白含量。1.3 统计学处理采用SPSS 21.0软件进行数据分析,所有数据资料均采用均数±标准差((?))表示,两组之间采用独立样本t检验分析,检验水准均为α=0.05。2 结果2.1 骨髓瘤血管内皮细胞的诱导和鉴定诱导结果:(1)CCK-8法检测增殖活性结果发现含20%和含50%体积分数上清液培养基诱导的MVECs增殖活性与对照组有差异(p<0.05),其中含50%体积分数上清液培养基诱导的MVECs增殖率最高;(2)transwell迁移和侵袭实验结果显示MVECs的迁移速率和侵袭效率高于对照组(p<0.05);(3)qRT-PCR结果显示MVECs中TEM1和TEM8的mRNA表达与对照组无明显差异;(4)ELISA结果显示MVECs内VEGFA的表达含量与对照组相比有差异(p<0.05)。2.2 RhoC shRNA转染MM血管内皮细胞对RPMI8226骨髓瘤细胞生物学行为的影响(1)各组内皮细胞的转染效率及RPMI8226细胞的分组培养慢病毒包装的RhoC shRNA质粒转染各组内皮细胞,在荧光倒置显微镜下观察MVECs和HUVECs的转染效率分别为(91.5±4.5)%和(89.4±3.6)%。收集转染后内皮细胞上清液分组培养RPMI8226细胞,得到MVECs-S培养组;MVECs-NC 培养组;HUVECs-S 培养组;HUVECs-NC 培养组。(2)各组RPMI8226细胞中RhoC蛋白和mRNA表达①Western blot检测各组RPMI8226细胞RhoC蛋白表达含量,MVEC-S组较MVECs-NC组RhoC蛋白表达含量降低(p<0.05),HUVECs-S组较HUVECs-NC组RhoC蛋白表达含量降低(p<0.05)。②qRT-PCR检测各组细胞中RhoC mRNA表达,MVECs-S组组较MVECs-NC组RhoC mRNA表达降低(p<0.05),HUVECs-S 组组较 HUVECs-NC 组 RhoC mRNA 表达降低(p<0.05)。(3)各组RPMI8226细胞的增殖和侵袭能力①采用流式细胞术检测细胞周期,与NC组比较,MVECs-S组和HUVECs-S组处于G0/G1期的细胞数增加,处于S期的细胞数降低(p<0.05),结果显示细胞周期阻滞发生在G0/G1期;②transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,与NC组比较,MVECs-S组和HUVECs-S组细胞侵袭能力降低(p<0.05)。(4)各组 RPMI8226 细胞中 PI3K、Akt、CDK、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达含量Western blot 检测各组细胞 PI3K、Akt、CDK、CyclinD1、MMP2、MMP9等蛋白表达含量,与NC组比较,MVECs-S组和HUVECs-S组细胞PI3K、Akt、CDK、CyclinD1、MMP2、MMP9 等蛋白表达降低(p<0.05)。第二部分下调MM细胞RhoC表达对MM移植瘤血管新生的影响1 材料和方法1.1 RhoC shRNA体内对MM移植瘤细胞增殖及血管生成能力的影响(1)分组转染RPMI8226细胞采用RhoC shRNA和RhoC shRNA-NC慢病毒载体转染RPMI8226细胞,转染方法同第一部分2.2.(1),细胞分组如下:1)RPMI8226-S组:慢病毒包装RhoC shRNA质粒转染的RPMI8226细胞;2)RPMI8226-NC 组:慢病毒包装 RhoC shRNA-NC 质粒转染的 RPMI8226细胞。(2)构建MM移植瘤模型SPF级5周龄健康BALB/c裸鼠10只(12-18g)。将(1)中培养的RPMI8226细胞分组皮下注射于裸鼠左前肢腋下。当裸鼠移植瘤长至1cm3大小,向裸鼠右前肢内注射混合有VEGF(100ng/ml)的Matrigel 500μl,作为血管生成诱生物。裸鼠分组如下:S组:每只注射100μl RPMI8226-S组细胞悬液(1.0×107/ml);NC 组:每只注射 100μl RPMI8226-NC 组细胞悬液(1.0×107/ml)。(3)观察各组MM移植瘤的生长自接种之日起,每隔两日观察裸鼠活动及肿瘤生长状况,成瘤后每周2次瘤体测量和记录(精确度为0.1mm),测量肿瘤的最长径a和最短径b,游标卡尺测量瘤体V≥100mm3且隔日不消退时,即可判定为荷瘤成功,即长直径约为6-7mm。自荷瘤成功开始,每周两次测量瘤体并观察瘤体生长及小鼠存活情况,第四周时脱颈法处死裸鼠,完整解剖取出左前肢的瘤体,游标卡尺测量各组肿瘤长(a)、宽(b),按下式计算瘤体积(V)=ab2/2,各组取平均值,绘制裸鼠肿瘤生长曲线图。(4)检测各组MM移植瘤内RhoC mRNA和蛋白表达MM移植瘤组织在冰上分别提取蛋白和mRNA,采用Western blot检测各组细胞中RhoC蛋白的表达,qRT-PCR检测各组细胞中RhoC mRNA的表达。(5)检测各组MM移植瘤的血管生成①第四周时处死裸鼠,取出右前肢腋下的Matrigel。显微镜(200×)下计数中血管生成的数目,计数图像中新生血管的长度(μm),每组随机获取五个图像,取平均值;②将骨髓瘤移植瘤制备为石蜡切片,免疫组化检测移MM植瘤内CD31的表达,倒置显微镜下高倍镜(400×)计数五个不重复视野内各组MM移植瘤组织中MVD。计数标准:于肿瘤组织内选取染色阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇,或血管腔内径<8个红细胞大小,且无肌层的血管。计数不重叠的5个视野内微血管。(6)检测各组MM移植瘤的细胞增殖免疫组织化学染色检测各组MM移植瘤内Ki-67的表达,高倍镜(400×)计数Ki-67阳性细胞,计数Ki-67指数即计数Ki-67阳性细胞比例,随机选取10个视野中阳性标记细胞占总细胞数的平均百分比。1.2统计学处理采用SPSS 21.0软件进行数据分析,所有数据资料均采用均数±标准差((?))表示,两组之间采用独立样本t检验分析,检验水准均为α=0.05。2 结果2.1成功构建MM裸鼠移植瘤模型采用皮下种植法成功种瘤10只裸鼠,荷瘤成功率为100%。接种15d时,接种部位肉眼可见微小隆起,未见自发消退现象,且随着时间增大,逐渐在皮下形成瘤结节。接种21d时,10只裸鼠均荷瘤成功。2.2各组MM移植瘤的生长成瘤后4W时处死裸鼠,剥离肿瘤,肉眼观察发现S组移植瘤体积小于NC组,但差异无统计学意义(p>0.05);成瘤4W内,绘制肿瘤生长曲线,S组较NC组瘤体体积略小。2.3 MM移植瘤内RhoC mRNA和蛋白表达采用qRT-PCR检测RhoC mRNA表达量,S组中RhoC mRNA较NC组表达水平降低,差异具有统计学意义(p<0.05);Western blot检测RhoC蛋白表达,S组较NC组RhoC蛋白表达含量降低(p<0.05)。2.4各组MM移植瘤的血管生成镜下计数基质胶内的新生血管并测定其长度。S组较NC组内血管新生数量降低,且血管新生长度短于NC组,差别具有统计学意义(p<0.05);S组基质胶内MVD值较NC组降低,差别具有统计学意义(p<0.05)。2.5各组MM移植瘤的细胞增殖S组与NC组比较,Ki-67阳性率降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论1 通过MM RPMI8226细胞上清诱导HUVECs后可以获得MVECs。2 下调MVECs中RhoC表达可影响MM细胞内RhoC mRNA和蛋白表达,并降低MM细胞增殖和侵袭能力。其机制可能与PI3K/Akt信号通路、细胞周期依赖性激酶CDK/细胞周期蛋白CyclinD1、MMP2/9相关。3 下调MM细胞RhoC表达体内可降低MM裸鼠移植瘤细胞增殖能力,抑制移植瘤内血管新生。