结直肠癌是一种常见的、严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤。在世界范围内,结直肠癌的发病率与死亡率均排在肿瘤病因的前3位；近十年来,结直肠癌在我国的发病率有逐年上升的趋势。肝脏转移是患者复发和死亡的主要原因。越来越多的研究表明,肿瘤干细胞的存在是结直肠癌发病的主要原因。肿瘤干细胞具有异质性,存在转移性肿瘤干细胞与非转移性肿瘤干细胞亚群,其中转移性肿瘤干细胞与肿瘤转移的发生有密切关系。我们课题组在前期的实验中,成功地从结直肠癌细胞株SW480中分离出肿瘤干细胞,并在动物在体实验中进一步筛选出转移性结直肠癌肿瘤干细胞与非转移性结直肠癌肿瘤干细胞。利用比较蛋白质组学,分离鉴定出多个与肿瘤转移相关的蛋白质,其中包括FUBP1和EFTU。FUBP1是一个与单链DNA结合的转录因子,与靶基因启动子上游较远端的FUSE位点结合,和其它蛋白形成复合体,一起调控包括c-Myc、p21等与细胞周期、凋亡相关基因,促进细胞增殖、存活、基质浸润等,在多种肿瘤组织与细胞株中高表达。FUBP1在结直肠癌肿瘤干细胞,尤其是在转移性肿瘤干细胞中的作用机制尚不清楚,有待进一步研究。EFTU是一个受核基因编码的线粒体转录因子,在线粒体的tRNA转运、线粒体的蛋白质合成、维持线粒体膜的完整性、膜电位的稳定性以及细胞呼吸链功能具有重要作用。EFTU也在多种肿瘤组织与肿瘤细胞株中高表达,EFTU局表达的结直肠癌病人的生存时间明显小于阴性表达的病人,是一个独立的预后不良指标。到目前为止,EFTU在结直肠癌干细胞中的作用以及与肿瘤转移的关系未见报道,特别是在转移性结直肠癌干细胞中具有哪些功能也不清楚,需要深入研究。本课题组分离筛选得到的转移性结直肠癌干细胞(MCSC)与非转移性结直肠癌干细胞(nMCSC)为深入研究与结直肠癌转移相关基因或蛋白分子的功能提供了非常好的实验材料,对提示结直肠癌的发病、转移机制具有重要价值。本研究拟从以下几个方面对FUBP1与EFTU的功能进行研究：1.首先用实时荧光定量RT-PCR和Western blot验证蛋白质组学的数据；2.为了研究FUBP1与EFTU的功能,构建FUBP1与EFTU的过表达与小分子干扰RNA的慢病毒；将包装好的慢病毒感染转移性结直肠癌干细胞与低转移性结直肠癌干细胞,并检验各个基因的表达水平；3.用细胞生长曲线(CCK-8法)、平板克隆形成实验、Transwell体外侵袭实验、细胞划痕实验等方法观察FUBP1与EFTU过表达,FUBP1与EFTU沉默对结直肠癌干细胞的增殖、克隆形成、侵袭及迁移能力等生物学功能的影响；4.裸鼠皮下注射肿瘤干细胞观察FUBP1与EFTU基因对肿瘤形成能力的影响,经裸鼠尾静脉注射肿瘤干细胞观察FUBP1与EFTU基因对肿瘤干细胞转移能力的影响；5.临床资料验证：对320例结肠癌患者石蜡标本进行FUBP1与EFTU免疫组化检测,观察2种蛋白与320例结肠癌患者临床病理资料和临床预后随访分析,探讨这2种蛋白质的表达与结直肠癌转移预后的相关性。结果：1.实时荧光定量RT-PCR与Western blot结果显示,在SW480、nMCSC、MCSC细胞中,FUBP1与EFTU的nRNA和蛋白质的表达水平具有相同的趋势：SW480中的表达水平高于nMCSC与MCSC,但是在nMCSC、MCSC相比,MCSC中的表达水平要高于nMCSC中的水平；2.我们用分子克隆的方法成功地构建了FUBP1与EFTU的过表达慢病毒,以及FUBP1-RNAi、EFTU-RNAi慢病毒,转染细胞检测表明,能够成功表达FUBP1、EFTU与GFP的融合蛋白；FUBP1-RNAi、EFTU-RNAi可以明显降低细胞内FUBP1与EFTU蛋白的表达,表明干扰序列具有沉默效果；3.(1)CCK-8法检测细胞生长曲线发现,在nMCSC、MCSC细胞,相对于空白对照慢病毒,FUBP1与EFTU过表达慢病毒组细胞的CCK-8的吸光度值明显大于对照组细胞,经统计学分析具有统计学意义(P<0.001)；而FUBP1、 EFTU的干扰慢病毒则对细胞的CCK-8吸光度有一定的抑制作甩,与对照慢病毒组相比,具有统计学意义(P<0.001)；(2)平板克隆形成实验的结果表明,过表达FUBP1与EFTU的nMCSC和MCSC细胞的克隆形成能力明显增强,差异具有显著的统计学意义(P<0.01),而干扰FUBP1与EFTU的水平的nMCSC、MCSC细胞的克隆形成能力则明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),表明FUBP1与EFTU能增强细胞的克隆形成能力；(3)侵袭小室结果发现,过表达FUBP1与EFTU的nMCSC、MCSC细胞穿透过细胞外基质层到达底部的数量明显多于载体对照组的细胞,差异具有统计学意义(P<0.01); FUBP1与EFTU小分子RNA干扰组的nMCSC、MCSC细胞穿透到下层的数量则少于载体对照组的细胞,差异同样具有统计学意义(P<0.05),表明FUBP1与EFTU基因能促进细胞的体外侵袭；(4)细胞划痕修复实验发现,过表达FUBP1、EFTU的MCSC和MCSC细胞的伤口距离明显小于对照组,而FUBP1、EFTU干扰组的nMCSC、MCSC细胞的伤口范围则大于对照组,表明FUBP1与EFTU过表达能提高nMCSC与MCSC细胞的迁移运动能力；4.裸鼠皮下成瘤实验结果：过表达FUBP1的MCSC细胞组,在第28天时肿瘤体积比对照组MCSC的肿瘤体积大,差异具有统计学意义(P=0.047),但在第35天时,两组间的肿瘤体积差异没有统计学意义(P=0.063)；过表达EFTU的MCSC细胞组的肿瘤体积明显大于对照组,差异具有统计学意义(P<0.001)；过表达FUBP1与EFTU的nMCSC细胞组的肿瘤体积均大于对照组,差异具有统计学意义(P<0.001)；在FUBP1、EFTU的RNA干扰组的MCSC与MCSC细胞组,肿瘤体积均小于空载对照组,差异具有统计学意义(P<0.001)；尾静脉注射转移模型结果显示,过表达或RNA干扰的空病毒组的nMCSC与MCSC细胞组,均发生了肿瘤转移,转移部位中,MCSC/OE-NC、MCSC/RNAi-NC、nMCSC/OE-NC、nMCSC/RNAi-NC分别为肺转移2/6、3/6、2/6、2/6,其中nMCSC/RNAi-NC有一例耳部转移；FUBP1过表达的nMCSC与MCSC细胞组的转移部位增多,肺(4/6),甲状腺(2/6),脊柱(1/6)；MCSC/EFTU过表达组的转移部位为肺(4/6),皮下及肠(1/6)；nMCSC/EFTU过表达组的转移部位为肺(3/5),甲状腺(2/5),皮下及胸骨(1/5)。在FUBP1-RNAi与EFTU-RNAi感染的nMCSC与MCSC细胞组中,发生转移的比例与转移部位明显减少,转移部位均局限于肺部,除了MCSC/FUBP1-RNAi组为2/6,其它干扰组均只发生1例肺转移。以上结果表明,FUBP1与EFTU过表达可以促进nMCSC、MCSC细胞的转移。5.临床结直肠癌患者标本的免疫组化结果显示,FUBP1高表达率为53.73%(172/320), EFTU高表达率为38.75%(124/320)；EFTU表达在患者的肿瘤临床分级(x=8.875,P=0.031)及转移(25.334,P=0.021)中有统计学意义。FUBP1在转移中有统计学意义(x=4.137,P=0.041)。生存分析结果显示,对于两种蛋白FUBP1和EFTU,高表达组的结直肠癌患者的术后生存时间较低表达组结直肠癌患者明显缩短,P均<0.001,具有显著性差异。Cox回归模型检验显示,与大肠癌患者预后显著相关的风险因素有5个,临床分期(OR=2.103,P=0.001)、肿瘤大小(OR=0.671, P=0.039)、FUBP1蛋白表达(OR=1.911,P=0.002)和EFTU蛋白表达(OR=2.411, P=0.001), FUBP1和EFTU蛋白表达的高低可以作为预测患者不良预后的独立生物学指标。结论：1) MCSC中,FUBP1与EFTU的mRNA和蛋白质水平高于nMCSC细胞；2)成功构建并包装了FUBP1与EFTU的过表达及RNAi慢病毒,成功感染了nMCSC与MCSC细胞株；3)体外实验证明,FUBP1与EFTU可以增强nMCSC、MCSC的增殖能力、克隆形成能力、体外侵袭能力与迁移运动能力；4)体内皮下成瘤实验与转移实验证明,FUBP1与EFTU过表达均可以增加nMCSC/MCSC细胞的肿瘤体积,促进MCSC、MCSC细胞的转移。5)临床资料分析显示,FUBP1与EFTU高表达与结直肠癌的转移性相关,可以作为独立的不良预后指标。