研究背景及研究目的:青少年特发性脊柱侧弯(Adolescent Idiopathic Scoliosis简称AIS)是一种伴有椎体旋转的脊柱结构性侧向弯曲的三维畸形。在儿童和青少年中的发病率国外报道为2%~5%,国内报道为1.5%~3%,重度畸形的发病率为0.2~0.5%,女性患者明显多于男性。虽然AIS除表现畸形外通常不引起严重的病理状态,但是重度胸弯可能引起心、肺功能的减退,导致明显的体型上的畸形,甚至影响寿命。目前治疗方法主要是针对畸形进行矫治,包括临床观察、支具治疗和对侧弯超过45o者进行手术治疗,治疗复杂,常遗留有脊柱畸形和脊柱活动障碍。效果不理想,理想的效果是消灭畸形。如果能够针对病因进行症状前诊治、出生前诊治,甚至对有家族史的已孕女性,在受精6天、胚胎着床之前进行基因诊断和治疗,杜绝脊柱畸形的出现,临床上将消灭AIS。但这需要首先明确病因,明确发病的基因机制。目前AIS的确切病因尚不清楚。既往大量的研究集中在软骨、骨骼、神经和肌肉等组织学因素的致病机制上面,但是没有明确结论。随着医学遗传学和医学分子生物学研究的不断深入和进步,临床上许多原因不明的常见病的发病机制被证明与遗传及致病基因有关。目前医学分子生物学的观点认为,人体各种疾病的发生,都是与一种或多种基因有关。这样人们自然想到AIS是否与遗传有关,近来许多学者认为AIS发病与遗传有关,如果与遗传有关,就需要确定它的遗传模(单基因遗传模式还是多基因遗传模式)和疾病基因的位置和疾病的分子机制,探讨遗传因素对疾病的影响和可能的遗传模式是遗传流行病学的任务。探讨疾病基因的位置和引起疾病的机制是医学分子生物学研究任务。AIS流行病学方面和遗传流行病学方面的研究报道很少,但这些研究都报道具有家族聚集性,认为有遗传因素,至于遗传模式,各家报道的结果不同一,有报道认为是常染色体显性遗传模式,有报道是X连锁显性遗传模式,还有报道是多基因遗传模式。也就是说AIS是不是遗传病,遗传模式是哪种还没有定论。没有确定的遗传模式,这对AIS疾病基因的染色体定位研究带来了障碍,进一步影响疾病基因的筛查与鉴定。在遗传病的疾病基因的染色体定位分析过程中,需要根据不同的遗传模式而采用不同的分析方法,一般单基因病采用连锁分析方法,多基因病采用相关分析法。如果分析方法反了或混合了,结果不言而逾,也就是说在遗传模式不确定的情况下,其分析的结果是不确定的,这也正是为什么现有的、关于基因染色体定位研究报道结果各异,无法统一的原因之一(亦有遗传异质性问题)。所以确定AIS是遗传病,是那种模式的遗传病的研究,也就是遗传流行病学方面的研究,对疾病基因的定位和基因机制的研究具有重要意义。AIS的医学分子生物学机制的研究已有部分报道,各学者从“正向”或“反向”两种策略进行研究,但目前仍处于疾病基因位点的早期染色体定位研究阶段,并且尚没有公认的同一的基因位点。“正向”研究策略(经典遗传学策略)既功能克隆法是从蛋白质或mRNA表达差异着手,采用以消减杂交为思路的多种分子生物学手段,先通过消减获得特异表达和缺失的基因片段,然后进行染色体定位乃至获得全基因。关于AIS病变部位不同组织的mRNA和蛋白质表达差异方面的研究已有许多报道,研究集中在对侧弯脊柱凸凹侧椎间盘内的Ⅰ、Ⅱ、X型胶原,TGF-?1、bFGF、成骨细胞蛋白质表达差异和ⅠⅡ、Ⅸ型胶原mRNA的表达差异方面,虽然均报道存在表达差异,但和组织学研究结果一样,这种差异“是因是果”难以确定,无法确定真正的病因。这种现状的原因是研究设计都是采用凸、凹侧对比,如果想找出真正的组织、蛋白或mRNA层面的差异,需要进行先证者自身发病前后对比研究,或先证者与正常人之间的对比研究,但是这在临床上是很难做到的,所以结果很难取得突破,那么只有寄希望于“反向”研究了。“反向遗传学”策略既医学分子生物学策略是应用定位克隆遗传分析法对疾病基因进行染色体定位和疾病基因的筛查与鉴定。这种方法是基于任何一个基因必定在染色体上有位点,基因所决定的遗传学性状与这些位点有密切联系的遗传学原理,通过遗传学分析,获得某些疾病基因在染色体上的位置信息,然后根据这一位置信息,应用“物理图”的物理标记将遗传学信息转变为“物理标记”所代表的明确的染色体区域,再以相关区域的“相连片段群”来筛选可表达的基因,建立该区域的“转录图”。最后,通过“定位候选克隆”和“功能候选克隆”方法比较病人与正常人这些结构基因的区别以确定与疾病相关的改变,筛查与鉴定出疾病相关基因。关于AIS疾病基因的定位克隆研究共检索到7篇文献,由于各个研究应用了不同的研究群体和遗传统计学分析方法,各家报道的染色体定位的位点各异,分别在染色体6、9、10q、16、17、17p11、19p13.3、19 p 13和Xq21上,还没有取得公认的定位结果。值得关注的是在定位克隆法研究中,有2位学者将疾病基因位点定在19p13 ,Alden研究的受试对象是美国人。Chan的报道不仅定位在19p13.3内,还进一步的精确定位于D19S216标志附近,在D19S894～D19S1034之间的5.2cM遗传距离,物理图约1.9Mb。研究的受试对象是中国广东人,采用400多个荧光标记的微卫星标志进行全基因组筛查,选用了参数和非参数两种相关分析的统计方法,基本排除了遗传模式对结果的影响,从一个家系中得到的结果在另外6个家系中得到验证,样本量大。文章的影响因子高达10.0以上,结果可信。此项研究虽然精确的定位到D19S216标志附近,但仍然属于疾病基因的染色体定位研究,未见后续的关于疾病基因的筛查与鉴定的研究报道。我们认为承认Chan的研究结果,在其研究基础上做进一步的研究——候选基因筛查,以期在AIS的疾病基因定位研究上取得突破性进展是值得的,是有创新的和有科学价值的。为了确定19p13.3内基因的数目,检索在3亚带内有198个已知基因,其中只有17个是已知疾病的基因,尚无与AIS相关的基因报道。如果要对3亚带内的198个基因进行筛查,从哪个基因开始是值得研究的。当然是选与AIS最相关的,Chan的精确区域定位是在D19S216标志附近,在物理图上查SH3GL1恰位于此区域内, Chan在报道中也指出SH3GL1是与破骨细胞代谢有关,可能是AIS重要的致病基因。首选SH3GL1。关于基因SH3GL1功能的研究报道不多,Wise等人报道基因SH3GL1与细胞吞噬作用有关,参与细胞内吞、外排偶联的Ca2+通道的调节。也有研究认为SH3GL1与人类的白血病有关。所以本项研究的目的一是对中国重庆AIS进行遗传流行病学调查分析,探讨遗传因素在发病中的作用和可能的遗传模式。二是采取定位候选克隆方法对AIS的疾病候选基因SH3GL1的外显子进行序列比对分析,研究是否存在碱基变异,为疾病基因筛查与鉴定做方法学准备。研究方法:1.遗传流行病学调查:设计AIS遗传流行病学调查表,收集在西南医院诊治过的先证者资料。确立诊断标准为站立前后位X线片Cobb角>10o为受累者, Cobb角<10o为易感者,年龄小于12岁的表型正常者为未确定者。由经过培训的调查员对先证者及其家系成员进行询问调查并填写调查表。方法为门诊、病房询问与电话询问相结合,为防止存在回忆偏倚对先证者、父亲和母亲分别进行询问记录。对怀疑受累者和易感者要进行临床望诊、Adam弯腰试验检查,必要时经过X线片检查确定。2.遗传流行病学统计分析:对遗传流行病学调查数据采用SPSS10.0统计软件进行分析。通过年龄发病率分析,家族聚集性分析,遗传度计算(Falconer法)分析确定遗传因素的大小。根据单基因和多基因遗传病的特点分析确定遗传模式。3.定位候选克隆:设计以家系为基础的“病例同胞对”研究方案,采集“同胞对”的血液标本,提取基因组DNA,根据基因SH3GL1核酸序列,以10个外显子为重点设计引物对,进行PCR扩增、克隆和测序。4.序列比对分析:用GeneTool软件对外显子测序结果,进行“同胞对”之间和同胞对与NCBI之间的序列比对分析,判断是否存在碱基变异,并进行蛋白质结构预测分析。研究结果:1.遗传流行病学调查:设计了AIS遗传流行病学调查表,并成功的对73个家系按调查表进行遗传流行病学调查。2.遗传流行病学统计:年龄发病率分析:发病75%在11～14岁之间,平均年龄10.84岁。家族聚集性分析:病例家族总发病率为4.86%,一级亲属的发病率为16.93%,二级亲属的发病率为7.21%,三级亲属发病率4.36%,而参照发病率为2.25%,统计学分析差异有显著意义(u=6.451,P﹤0.01 )。遗传度计算:先证者一级亲属的遗传度84%、二级亲属的遗传度88%和三级亲属的遗传度85%,经显著性检验(P<0.01)各级亲属遗传度有统计学意义。3.定位候选克隆:候选基因SH3GL1中的10个外显子成功的在AIS“同胞对”的基因组DNA中得到扩增和克隆,并且序列测定均取得阳性结果。4.序列比对分析:通过比对分析在候选基因SH3GL1的10个外显子中,共发现12处碱基变异,分别位于第2(2处)、4、5(3处)、6、8和10(2处,非编码区)六个外显子上。其中先证者基因编码mRNA第515位碱基如果为T,则形成终止密码子(TAG),导致蛋白阅读框发生改变(可能为107-518区域碱基,或为707-1213碱基),蛋白质序列预测分析显示编码截短蛋白,从而影响蛋白质的一级结构。结论:1.AIS是遗传病:年龄发病率分析显示75%在11～14岁之间,比较集中,属于遗传病的特点;病例家族发病率和先证者一级亲属、二级亲属和三级亲属的发病率均明显高于参照群体平均发病率,具有明显的家族聚集性;一级、二级和三级亲属的遗传度均大于84%,证明AIS与遗传显著相关。综合上述分析结果证明AIS是遗传病。2.AIS是多基因遗传病:先证者的各级亲属发病率均明显高于参照人群发病率;同胞发病率远比1/2或1低;与先证者的亲缘关系越近,发病率越高,有明显的家族性聚集倾向。综合分析证明AIS属于多基因遗传病。3.基因SH3GL1是AIS的致病基因之一:碱基序列比对分析证明外显子区域内的10处碱基变异位于编码区属于结构基因的变异,2处位于非编码区内的变异可能处于调控区域,先证者SH3GL1第5外显子的第515位碱基如果发生C→T突变,将形成终止密码子,导致蛋白阅读框发生改变,通过氨基酸序列预测分析,编码截短蛋白,从而显著影响蛋白质的结构。由此可以证明基因SH3GL1是AIS候选基因之一。