论文部分内容阅读
目的:非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是最常见的全球慢性肝病之一,最早病理表现是肝脏脂肪变性,可发展为非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）和肝纤维化,甚至进展为肝硬化和肝细胞癌。其发病的分子机制至今未明。本研究通过芯片技术,筛选兔脂肪变血清和肝组织差异表达的lncRNAs并对其进行交集分析筛选出lncRNA-uc007gqg.1,进而对uc007gqg.1进行基因生物学信息分析,通过动物和细胞实验探讨其表达规律及对内质网应激和线粒体自噬的调节作用,从而为该疾病寻找生物学标志物和潜在干预靶点提供依据。方法:1.以高通量lncRNA芯片技术,对兔脂肪变血清和肝组织进行相关lncRNAs的筛选,进一步对血清和肝脏来源差异表达的lncRNAs进行交集分析,进而对筛选出的uc007gqg.1进行基因生物学信息分析。2.将80只8周龄新西兰雄性大耳白兔随机分为2组,对照组40只给予标准饮食8w,实验组40只给予高脂饮食（High fat diet,HFD）喂养8w制备NAFLD模型。分别在造模第1、4、6、8w动态检测两组兔血生化指标;收集肝脏组织观察病理表现;分别以实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time PCR,qPCR）和 Western-Blot检测血清和肝脏组织uc007gqg.1基因和肝脏组织GRP94、Caspase-3、PINK1、Parkin等蛋白表达水平,通过ELISA法检测血清GRP94和Caspase-3蛋白表达水平。3.通过油酸钠处理小鼠正常肝细胞NCTC1469建立NAFLD体外模型,并以siRNA有效靶点转染细胞沉默uc007gqg.1,实验设计分6组:①SO（cell+油酸钠）、②SO-Ctrl（cell+油酸钠+无作用对照siRNA）、③Neg（cell空白组无任何处理）、④Ctrl（cell+无作用对照siRNA）、⑤Neg-Si和cell+siRNA有效靶点)、⑥SO-Si（cell+油酸钠+siRNA有效靶点）;收集各组细胞以甘油三酯（Triglyceride,TG）试剂盒检测细胞内TG含量;油红O染色观察各组细胞脂质沉积;qPCR 和 Western-Blot 检测 lncRNA-uc007gqg.1 基因和 GRP94、Caspase-3、PINK1、Parkin等蛋白表达水平。结果:1.基因芯片结果显示,脂肪变肝脏组织差异高表达5倍以上的lncRNA有78条,差异低表达5倍以上的lncRNA有132条,进一步交集分析发现有3条lncRNA（uc007gqg.1,NR028591,uc029syw.1）不但在各自差异表达谱中差异倍数较大（差异倍数均≥5）,且同时差异表达于血清差异表达谱和肝脏差异表达谱中。基因生物学信息分析显示uc007gqg.1与GRP94无论在人还是在兔、鼠基因组中均为毗邻关系。2.动物实验结果:实验组血生化指标显著高于对照组,呈现时间依赖性,差异有显著性（P<0.05）;与对照组比较,实验组LDL、HDL、ALT、AST、TC水平在造模1周时开始增高,4周时最高,6周和8周时升高程度较低,呈动态变化,差异有显著性（P<0.05）;ALB、TB、CRP水平在造模1周时开始增高,6周时最高,8周时升高程度较低,呈动态变化,差异有显著性（P<0.05）;GGT、TG、ALT与AST比值水平在造模1周时开始升高,4周和6周时升高程度较低,8周时最高,差异有显著性（P<0.05）。肝脏病理见6w时肝细胞脂滴沉积增加,脂肪样变明显增加,呈气球样变性,8w时最严重,随造模时间延长而加重,差异有显著性（P<0.05）;与对照组比较,实验组血清和肝组织uc007gqg.1基因和GRP94、Caspase-3蛋白表达水平均明显增加,呈动态变化,4w时开始增加,8w时增加最显著（P<0.05）,uc007gqg.1与GRP94在血清和肝组织中均呈正相关（血清:r=0.996,P=0.004,P<0.05;肝组织:r=0.985,P=0.015,P<0.05）,uc007gqg.1 与 Caspase-3 在血清和肝组织中均呈正相关（血清:r=0.968,P=0.007,P<0.01;肝组织:r=0.977,P=0.004,P<0.01）。与对照组比较,实验组肝组织PINK1和Parkin蛋白相对表达量在各时间点分别呈降低趋势,呈动态变化,1w时开始减少,4w和6w时持续降低,8w时这两个蛋白表达量降低最明显（P<0.05）。肝组织uc007gqg.1基因与PINK1和Parkin蛋白表达量均呈相反趋势,均呈负相关（r=—0.888,P=0.044,P<0.05）;（r=—0.961,P=0.009,P<0.01）;与对照组比较,实验组肝组织p62蛋白相对表达量在各时间点分别呈增加趋势,呈动态变化,8w时增加最明显（P<0.05）,肝组织uc007gqg.1基因与p62蛋白表达量均呈相同趋势,呈正相关（r=0.911,P=0.032,P<0.05）。3.NAFLD体外模型结果显示:与③Neg组比较,①SO组可见细胞内TG含量显著增加（P<0.05）;细胞内油红颗粒数量显著增加,大量脂肪颗粒集聚;uc007gqg.1基因和GRP 94、Caspase-3蛋白表达量明显增加（P<0.05）,PINK1、Parkin蛋白的相对表达量明显减少,p62蛋白的相对表达量明显增加（P<0.05）;与①SO组比较,⑥SO-Si组可见细胞内TG含量略增高,无显著差异（P>0.05）;油红颗粒数量显著减少,极少量脂肪颗粒集聚;uc007gqg.1基因和GRP 94、Caspase-3蛋白表达量明显减少（P<0.05）;PINK1和Parkin蛋白表达量明显增加,p62蛋白相对表达量显著减少（P<0.05）;比较①、③、⑥组细胞,uc007gqg.1与GRP 94和caspase-3蛋白表达量趋势均相同,呈显著正相关（r=0.901,P=0.014,P<0.05;r=0.977,P=0.001,P<0.05）;而 uc007gqg.1 与 PINK1 蛋白表达趋势则相反,但无显著差异（r=—0.809,P=0.051,P>0表达趋势相反,呈负相关,差异有显著性（r=-0.906,P=0.013,P<0.05）;uc007gqg.1.05）;uc007gqg.1 与 Parkin 蛋白与p62蛋白表达量呈相同趋势,呈显著正相关（r=0.901,P=0.014,P<0.05）。结论:1.GRP94可能是lncRNA-uc007gqg.1诱导肝脂肪变肝细胞损伤的潜在靶基因。2.兔脂肪肝模型:体内肝脏组织中uc007gqg.1可能参与调节脂肪肝细胞内GRP94、Caspase-3和PINK1、Parkin等蛋白的变化并与ERS和线粒体自噬密切相关,共同影响肝细胞凋亡,与NAFLD的发生和发展紧密相关,提示lncRNA-uc007gqg.1可能是防治该疾病的一个新靶点。3.NCTC1469小鼠脂肪肝细胞模型:体外肝细胞中uc007gqg.1可能通过影响ERS和线粒体自噬水平促进细胞凋亡和损伤引起NCTC1469小鼠肝细胞脂质沉积。提示lncRNA-uc007gqg.1可能作为NAFLD的早期生物标志物和作为疾病干预的药物靶标。体内外研究结果均提示,lncRNA-uc007gqg.1可能参与了 NAFLD的疾病进展,但更确切的结论和机制有待扩大动物和临床标本进一步研究,以期阐明uc007gqg.1和NAFLD疾病进展之间的相关性。