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目的利用分离、培养的乳鼠原代心肌细胞,建立缺氧复氧(Hypoxia-reoxygenation,HR)损伤模型,明确解偶联蛋白2(Uncoupling protein-2,UCP2)在HR损伤中的表达情况及其保护作用,探讨其与去乙酰化酶3(Sirtuin-3,SIRT3)的关系,进一步分析UCP2是否通过SIRT3调控线粒体氧化应激和线粒体动力学发挥心肌保护作用,为HR损伤心肌保护作用的研究提供新的研究方向和奠定理论基础。方法1 HR损伤模型的建立分离原代心肌细胞,培养48小时后,进行HR处理。检测心肌细胞中UCP2的蛋白表达和心肌损伤标志物水平,以蛋白表达最高且心肌损伤标志物明显升高所对应的HR时间为本实验建模时间。2心肌细胞损伤评价按照相应ELISA检测试剂盒说明书对CK、LDH、cTn-T进行检测;台盼蓝(Trypan blue,TBE)染色检测心肌细胞存活率;CCK8法检测心肌细胞活力;根据Annexin V-FITC/PI试剂盒,用流式细胞仪检测细胞凋亡。3线粒体氧化损伤评价用二氢乙锭(DHE)荧光探针检测心肌细胞ROS;用JC-1探针检测线粒体膜电位;按照ATP检测试剂盒说明书,用化学发光仪测定心肌细胞中ATP含量;根据相应ELISA试剂盒检测心肌细胞内MDA、SOD和GSH含量。4线粒体动力学检测利用线粒体外膜受体TOM20和活细胞线粒体特异性染料MitoRed对线粒体进行染色,于激光共聚焦显微镜下观察、拍照;Western blot检测线粒体分裂融合蛋白表达。结果1 UCP2减轻心肌细胞HR损伤HR损伤后检测发现,细胞活力、细胞存活率明显降低,细胞培养上清中心肌损伤标志物水平明显上升,说明HR模型建立成功。UCP2过表达后,以上损伤得以缓解;而将UCP2沉默后,相比于HR组,细胞损伤进一步加重;当将UCP2沉默后再过表达,发现UCP2的沉默效应得到一定程度逆转(均P<0.05)。2 UCP2减少线粒体氧化应激和线粒体分裂与常氧(Normoxia)组相比,HR组ROS产生明显增加,线粒体膜电位和ATP产量明显降低,线粒体分裂相关蛋白表达明显增加、融合蛋白表达明显降低(均P<0.05)。UCP2过表达后,与HR组相比,线粒体氧化损伤与线粒体分裂程度减轻;将UCP2沉默后,相比于HR组,线粒体氧化损伤和线粒体分裂加重;当将UCP2沉默后再过表达,发现其线粒体氧化损伤与线粒体分裂的严重程度得到一定逆转。3 UCP2可调控SIRT3的表达随着HR时间改变SIRT3的蛋白表达趋势与UCP2相一致,且均为H12R3时间点表达最高;检测NAD~+/NADH发现,相对于Normoxia组,UCP2过表达后NAD~+/NADH含量增加(P<0.05),UCP2沉默后NAD~+/NADH含量明显降低(P<0.05);另外经基因操作UCP2过表达后,SIRT3 mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.05),UCP2沉默后SIRT3 mRNA和蛋白表达也降低(P<0.05),但当沉默SIRT3后UCP2表达却并未降低(P>0.05);经免疫荧光检测发现,SIRT3与UCP2存在共定位(r=0.873,P<0.001)。4 UCP2-SIRT3减少线粒体氧化应激和线粒体分裂进一步研究发现,与HR组相比,当沉默SIRT3后心肌细胞损伤程度和线粒体氧化应激及分裂程度进一步加重;但当沉默SIRT3再过表达UCP2后发现,前者的损伤程度并未得到明显逆转(P>0.05),进一步说明UCP2的心肌保护作用依赖于SIRT3的存在。结论UCP2具有减轻HR损伤的心肌保护作用;UCP2具有降低心肌细胞氧化损伤和心肌线粒体分裂、稳定线粒体动态平衡的作用;UCP2可能依赖于SIRT3发挥保护作用,即UCP2-SIRT3通路通过调控细胞氧化应激和线粒体动力学(分裂、融合)发挥HR损伤心肌保护作用。