目的:糖尿病是一种多病因、复杂的代谢紊乱性疾病,伴随极高的致残率和致死率,与癌症、心血管疾病并称为世界三大疾病。西药治疗虽能有效地快速的控制高血糖,但不足之处是对慢性并发症的预防和治疗仍缺乏有效措施,除此之外,连续服用口服降糖药物会出现药物失效、高胰岛素血症和胰岛素抵抗等问题。而中药因多成分、多靶点、多种作用机制等特点,从而产生一个或多个显著的整体药理作用,共同产生药效,符合糖尿病复杂的病理特点;并且具有疗效稳定、毒性小、不良反应少可长期使用等优势。近年来,在糖尿病的预防和治疗研究中甚为活跃。自古以来,历代医书都有桑叶治疗消渴症的记载,如《本草纲目》有载"桑叶乃手、足阳明之药......止消渴",日本古书《吃茶养生记》也记载桑叶有改善"饮水病"(即现代医学的糖尿病)的作用。研究已经证实,microRNA(miRNA)通过调控复杂的细胞信号通路网络和对细胞的多方面生物学行为影响,直接或者间接参与多种疾病的发生和发展进程。鉴于此,本课题从整体、细胞和基因转录后调控水平三个层面,研究桑叶对2型糖尿病胰岛β细胞功能的保护作用,并进一步探索miRNA介导细胞凋亡的相关性,从而阐明桑叶活性部位保护胰岛细胞、改善2型糖尿病的作用机制。方法:1.采用正交设计法对桑叶总黄酮、总生物碱及总多糖进行提取工艺筛选,以提高各类成分的提取率。其中,由于桑叶生物碱与黄酮类成分的极性较为接近,两类成分的提取条件在同一正交试验中进行。在纯化方法上,采用基于不同原理的分离手段提高各活性部位的纯度。桑叶总黄酮采用聚酰胺与大孔树脂串联柱层析法进行分离,桑叶生物碱采用酸碱溶液分离法与阳离子交换树脂相结合,桑叶多糖采用三氯乙酸沉淀法、水提醇沉法及透析分离法等进行纯化。2.采用高糖高脂饲料喂养,结合腹腔注射低剂量STZ的方法诱发2型糖尿病大鼠模型的发生,分别给予桑叶总多糖1000mg/kg.d-1、桑叶总黄酮350 mg/kg.d-1及桑叶总生物碱30 mg/kg.d-1进行干预治疗,持续定时给药6周。通过大鼠空腹血糖及胰岛素分泌水平的测定以及相关病变组织(胰、肝、肌肉、肾和肺)的形态学观察等,综合评价桑叶活性部位对2型糖尿病大鼠病变组织器官的影响。3.CCK8法检测INS-1细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,qRT-PCR法检测caspase3、Bax、Bcl-2在基因水平的变化,探讨桑叶活性部位对INS-1细胞损伤及凋亡的保护作用;在此基础上,进一步采用miRNA基因芯片分别检测各组间miRNAs的差异表达水平,并运用miRanda,targetscan,miRBase等microRNA生物信息学数据库对候选miRNAs的靶基因进行交叉、富集分析,引入KEGG及GO软件深入挖掘靶基因的生物功能及生物信息途径富集分析,由此构建主效基因的miRNA-mRNA调控网络,探讨miRNA介导INS-1细胞凋亡的转录后水平的调控作用。结果:1.桑叶总黄酮提取的工艺条件最终确定为A3B1C1D3,即回流浸提3次,溶剂用量为5倍,浸提时间为1h,乙醇体积分数为70%,纯化后桑叶总黄酮的平均含量为81.42%。桑叶总生物碱提取的工艺条件最终确定为A3B4C1D1,即回流浸提3次,溶剂用量为8倍,浸提时间为1h,乙醇体积分数为50%,纯化后总生物碱的平均含量为16.80%。桑叶总多糖提取的工艺条件最终确定为A1B3C3,即以加水量为6倍,浸提时间为2h,浸提次数为3次,纯化后桑叶总多糖的平均含量为67.55%。2.桑叶活性部位均有显著的降血糖作用,其中桑叶总多糖及总黄酮对正常大鼠均有不同程度的降血糖及促进胰岛素分泌的作用。镜下观察可见,相比于T2DM模型组,桑叶总多糖干预组、总黄酮干预组、总生物碱干预组浅染的胰岛体积较大、呈较规则的卵圆形,边界清晰,分泌细胞较密集;肝细胞较正常,肝索结构修复;肌纤维束基本紧密和整齐;肾小球结构基本正常,囊腔比例基本正常,肾小管上皮细胞扩张和肿胀程度下降;肺泡囊和肺泡扩张不明显。初步可以推断,桑叶总多糖、总黄酮及总生物碱对糖尿病大鼠胰腺、肝脏、肾脏、肌肉组织及肺组织损伤,在形态上均呈现出不同程度的改善作用。3.桑叶总多糖干预组、总黄酮干预组、总生物碱干预组均能减轻高糖诱导的INS-1细胞损伤和凋亡(P<0.05orP<0.01),下调促凋亡因子caspase3、Bax在mRNA的表达(P<0.05),上调抗凋亡蛋白Bcl-2在mRNA水平的表达(P<0.05);从miRNAs差异表达谱分析可以得出:(1)比较阴性对照组,高糖处理24h组显著差异的miRNAs共有283个,其中上调有202个,下调有81个;高糖处理48h组显著差异的miRNAs共有293个,其中上调有174个,下调有119个;(2)比较高糖处理24h,桑叶总多糖干预组显著差异的miRNAs共有351个,其中上调有171个,下调有180个;桑叶总黄酮干预组显著差异miRNAs共有239个,其中上调有107个,下调有132个;桑叶总生物碱干预组显著差异miRNAs共有373个,其中上调有169个,下调有194个;(3)比较高糖处理48h,桑叶总多糖干预组显著差异的miRNAs共有96个,其中上调有46个,下调有50个;桑叶总黄酮干预组显著差异miRNAs共有236个,其中上调有122个,下调有114个;桑叶总生物碱干预组显著差异miRNAs共有187个,其中上调有48个,下调有138个;经miRNA芯片结果qRT-PCR验证,其中rno-miR-30d-5p、rno-miR-126a-3p、rno-miR-375-3p 等的验证结果与基因芯片结果一致。结论:1.建立的桑叶总黄酮、总生物碱及总多糖的提取纯化工艺操作简便、条件稳定、重复性好。三种活性部位的纯度均较前期课题组有显著提高,其中,总黄酮及总多糖的含量大于50%。2.桑叶总多糖、总黄酮及总生物碱对2型糖尿病大鼠胰腺、肝脏、肾脏、肌肉组织及肺组织损伤,在形态上均有一定的改善作用;且桑叶总多糖及总黄酮对正常大鼠均有不同程度的降血糖及促进胰岛素分泌的作用。3.桑叶总多糖、总黄酮及总生物碱可通过抑制线粒体凋亡途径的发生,保护高糖诱导的胰岛INS-1细胞损伤和凋亡;通过miRNA芯片结果qRT-PCR验证,得出其中主效基因rno-miR-30d-5p、rno-miR-126a-3p及rno-miR-375-3p等的表达水平与基因芯片结果一致;初步判断在2型糖尿病发生机制中,rno-miR-30d-5p可直接通过靶向Atg12自噬因子介导细胞自噬,从而调控胰岛β细胞凋亡,也可靶向IRS1蛋白介导胰岛素抵抗,同时还涉及多个信号通路间接性参与2型糖尿病的生物学过程;而另一已验证的rno-miR-126a-3p主要靶向p1k2因子介导细胞周期,从而调控β细胞凋亡,同样也靶向IRS1蛋白介导胰岛素抵抗和多个相关信号通路。