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目的构建可用于高通量筛选JAK-STAT6信号传导通路抑制剂的工程细胞株,建立稳定可靠的筛选方法。在此基础上对1600种结构多样性的小分子化合物进行了筛选,并对筛选得到的可有效抑制JAK-STAT6通路的2种化合物进行了相关抑制机理的初步探讨,为最终获得针对性治疗哮喘等过敏性疾病的新药研发奠定基础。方法1.利用脂质体法将带有STAT6特异性识别启动子IgE基因序列(其后连有虫荧光素酶报告基因)的质粒IgE-luc和表达潮红霉素B的质粒共转染至HeLa细胞,经潮红霉素B抗性筛选及报告基因检测,得到稳定表达虫荧光素酶的工程细胞株。2.通过优化溶剂DMSO浓度, IL-4作用浓度及孵育时间等筛选条件,建立可靠的筛选方法,并在此基础上对1600种化合物进行了筛选。3.应用MTT法和流式细胞检测技术,观察高通量筛选得到的抑制效果较理想两种化合物NC000383, NC000438(化合物A,B)在不同剂量和不同作用间隔时间下对HeLa细胞代谢活力,增值及细胞周期的影响；观察化合物对IL-4诱导的BJAB细胞CD23分子表达的影响；利用磷酸钙瞬时转染技术,建立在IFN-Υ或IL-4刺激后可表达虫荧光素酶的细胞。通过报告基因的检测,探讨化合物对JAK-STAT6通路作用的特异性。结果1.通过对构建的多个细胞克隆的荧光素酶活性的检测,我们获得了依赖于STAT6活性的稳定表达细胞株,该细胞株可作为后期高通量筛选的细胞模型。2.通过对筛选条件的优化,结合操作的可行性,确定了高通量筛选时IL-4作用时间为8小时,终浓度为20ng/ml;化合物溶剂DMSO浓度体积百分比低于1。在此条件下,系统Z’因子达到0.64。通过对1600种化合物进行筛选,得到3种抑制效果较理想的化合物,选中率为1.85%o,其IC50值分别为：12.1μmol/L,16.5μmol/L,7.5μmol/L。3.MTT检测结果显示,在一定的剂量下,两种化合物对HeLa细胞代谢活力和增殖均有一定抑制作用,这种抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性,并与细胞接种密度相关。其中化合物A剂量为1.0ug/ml时,对细胞代谢活力抑制率高于50%,化合物B则在25%以内。流式细胞仪检测结果显示两种化合物均可引起HeLa细胞周期的延迟,表现为G2-M期阻滞及S期蓄积(P<0.05),各剂量组之间变化也具有显著性(P<0.05)。同时能降低由IL-4介导的BJAB细胞CD23分子的表达。在所测试的三个剂量组中(A:0.25μg/ml,0.5μg/ml,1.0μg/ml; B:1.0μg/ml,1.5μg/ml,2.0μg/ml),随着化合物剂量的增加,CD23分子的表达水平逐渐降低。细胞瞬时转染结果显示两种化合物均能降低相应细胞因子刺激引起的分别依赖于STAT1和STAT6信号传导通路活性的荧光素酶的表达,统计学分析无显著差异,显示两种化合物对STAT6通路的抑制不具有特异性。结论1、建立了基于JAK-STAT6信号传导通路的工程细胞株和稳定可靠的高通量筛选系统,并利用该系统,得到3种可有效抑制该传导通路的化合物。2、通过对其中两种化合物作用机理的初步探讨,推测化合物可能由于某些因素使细胞周期延长,细胞代谢活力下降,细胞增殖迟缓,进而引起相关基因(如IgE)的表达降低,其受体CD23表达亦降低,从而对IgE-luc细胞荧光素酶表达产生抑制作用。这种抑制作用对STAT6和STAT1通路均有影响。我们将在后期的实验中继续探讨化合物引起的细胞周期的延长以及CD23分子表达降低的机理。同时将对其它可能作用位点进行检测以及相关动物水平的研究。并期望以此深入,进一步探讨STAT6激活基因转录调控的分子机制,为治疗与该信号传导通路相关的哮喘等过敏性疾病的新药研发奠定基础。