研究背景:无毛基因(Hairless,Hr)是一个含有锌指结构并与毛发生长密切相关的一个基因,该基因编码一个高表达于皮肤和脑部的转录因子,调控甲状腺受体的转录,基因产物作用于毛囊细胞,控制着毛囊细胞的增殖、分化与细胞凋亡之间的平衡,在毛囊中的表达具有周期性,从而影响毛发的生长周期转换,无毛基因的缺失导致毛囊再生受到阻碍,引发形成一种复杂的皮肤表型[1-4]。无毛基因的突变是于1924年首次在小鼠身上被发现[5],无毛基因突变引发的小鼠的皮肤和被毛的形态发生异常,造成小鼠毛发脱落,但是Hr突变小鼠在出生后第一次的毛囊形成和毛发的表型都是正常的。目前对毛发生物学的研究,我们难以知道毛发的形态发生到底是怎样的机制,哪些因子对毛发具有真正的调控作用。本课题通过构建Hr基因敲除小鼠模型研究毛发生长脱落的作用机制,对基因的功能和蛋白质表达水平方面的实验结果进行分析,揭示出毛发的生长调控受相关基因表达水平变化的影响。研究方法:1.利用TALEN基因修饰技术构建Hr基因敲除小鼠模型,提取子代小鼠DNA、PCR扩增、测序、阳性鉴定,Hr基因敲除小鼠品系稳定繁育;2.构建成功的Hr基因敲除纯合子小鼠作为主要实验对象,观察记录不同日龄Hr基因敲除小鼠的形态学和皮肤组织学切片病理变化;3.取不同日龄的Hr基因敲除纯合子小鼠和野生型小鼠的背部皮肤组织为实验材料,IHC法探究Hr突变基因在毛囊结构中的表达部位,RT-PCR和Western blot法检测mRNA和HR的表达水平。研究结果:1.本实验室成功构建两种Hr基因敲除小鼠模型,第一种是Hr编码序列的86-87位缺失两个碱基GT,第二种敲除小鼠品系是88-89位点AC碱基缺失,本实验室现已稳定繁育出这两种Hr基因敲除品系小鼠,其遗传特征遵循孟德尔遗传定律。2.敲除纯合子小鼠出生后约两周,毛发从腹部开始脱落,头部和背部毛发稀疏并逐渐脱净,终生不再长毛,两种敲除品系纯合子小鼠的毛发表型相似,但是Hr基因敲除杂合子小鼠毛发表型正常;基因敲除纯合子小鼠21日龄时的皮肤组织中毛囊结构解体,28日龄皮下组织开始形成小的包囊结构,6月龄的小鼠皮肤组织中无规则排列着大小不等的包囊。3.通过IHC检测HR的表达部位,结果显示21日龄、28日龄、6月龄基因敲除小鼠毛发的皮肤组织中均明显可见HR表达,野生型小鼠仅处于休止期的毛囊结构中有表达,其它时期仅有少量表达。4.实时荧光定量PCR检测mRNA的表达量与Western blot检测的蛋白表达水平一致,基因敲除小鼠(KO)与野生型小鼠(WT)出生后7天(P7)和21天Hr的表达差异不显著(P>0.05),14天KO的Hr的表达量明显高于WT,差异显著(P<0.05),28天时KO的Hr表达与21天相比无明显变化,28天时WT的Hr表达量显著低于KO(P<0.05)。敲除纯合子小鼠皮肤组织中Hr在脱毛期均高水平表达,而野生型小鼠的毛囊结构仅处在毛发休止期时表达较高,实验结果分析可知Hr的表达水平调控毛发的生长发育机制。研究结论:1.Hr基因的敲除可以导致毛发生长异常,构建的Hr基因敲除小鼠遗传背景比较清楚,可以被用来作为研究某些皮肤疾病、毛发疾病及其衰老机制的动物模型。2.Hr敲除小鼠毛发脱落的皮肤结构发生显著的病理变化,在脱发阶段小鼠的毛囊结构退化瓦解;Hr基因正常功能的缺失导致毛囊重新形成过程受阻,引起毛发生长异常。3.HR的表达参与调控毛发的生长发育机制,Hr突变体小鼠皮肤组织中HR高表达引起小鼠毛发脱落,通过本课题的研究为现代人类面临的脱发症、斑秃等毛发疾病的病因及其分子机制的研究提供实验材料和理论基础。