第一部分肾小管上皮细胞内吞及自噬相关蛋白Rab7与基质金属蛋白酶-2的相关性研究目的:收集不同种类肾脏疾病的临床肾活检标本,检测内吞及自噬相关蛋白Rab7与基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的蛋白表达,并分析两者之间的相关性。观察这些肾活检标本中肾小管基底膜的厚度,以期从临床标本中获得进一步进行机制研究的信息和思路。方法:收集不同种类肾脏疾病的人体肾穿刺组织标本共77例,伴有不同程度的蛋白尿,病种包括:Ig A肾病(Ig A N)、糖尿病肾病(DN)、膜性肾病(MN)、局灶节断性肾小球硬化(FSGS)及狼疮性肾炎(LN)5种,制成石蜡切片,免疫组化检测Rab7和MMP-2的蛋白表达,并在此基础上用过碘酸希夫氏染色(PAS染色)进行套染,观察肾小管基底膜。统计学软件SPSS 19.0分析MMP-2和Rab7的蛋白表达是否具有相关性。结果:MMP-2和Rab7的阳性表达呈现棕黄色颗粒,主要表达在基底膜无明显增厚的肾近曲小管上皮细胞的胞浆中,且两者之间呈正线性相关关系,线性相关系数为0.6036(p<0.0001)。肾小管周围纤维化且基底膜明显增厚的小管上皮细胞Rab7表达较弱。结论:蛋白尿病人的肾小管上皮细胞中内吞及自噬和MMP-2之间存在相关性。小管上皮细胞损伤状态不同,Rab7表达有别;由于肾穿组织少,不能测MMP-2活性,但小管基底膜增厚则提示局部MMP-2活性不足。内在机制有待阐明。第二部分白蛋白过载的大鼠肾纤维化模型的建立与Rab7表达、MMP-2活性变化观察目的:为了进一步证实蛋白过负荷导致的小管上皮细胞Rab7表达、MMP-2活性变化规律,构建白蛋白过载的大鼠肾纤维化模型,观察大鼠肾组织中肾小管上皮细胞形态变化,内吞、自噬、MMP-2活性以及肾纤维化情况。方法:Wistar雌性大鼠共20只,随机分为两组,每组10只,即正常对照组(生理盐水组)和模型组(白蛋白过载组)。模型组大鼠每日腹腔注射1000mg的BSA溶液,正常对照组大鼠每日腹腔注射生理盐水,实验第1周末两组各处死5只动物,取肾组织检测Rab7的表达。其余动物持续注射10周。收集大鼠24h尿液测尿蛋白、尿NAG值。心脏采血检查血肌酐。大鼠肾组织石蜡切片常规HE染色、天狼猩红染色、免疫组化染色检测a-SMA、Vimentin的表达以评估肾损伤及纤维化程度。电镜观察肾小管超微结构,肾小管上皮细胞的内吞及自噬情况。明胶酶谱法检测肾组织MMP-2的活性。Western Blot检测IV型胶原、MMP-2、LC3(47)、P62和Rab7的表达。判断大鼠肾组织中自噬和胶原沉积情况。结果:先前处死大鼠肾组织Rab7表达在模型组高于对照组。模型组大鼠24h尿蛋白及NAG指数明显高于对照组,血肌酐未见明显差异。HE染色显示肾小管间质炎细胞浸润、成纤维细胞增生、小管出现管型、小管上皮细胞水肿。天狼猩红染色显示模型组胶原沉积较重。免疫组化染色结果显示模型组大鼠肾组织a-SMA及Vimentin的表达较对照组强。电镜结果显示模型组大鼠肾小管上皮细胞自噬减少。Western Blot结果显示,与对照组相比,模型组大鼠肾组织胶原IV和MMP-2表达增加,LC3(47)和Rab7表达下降。明胶酶谱法结果显示模型组大鼠肾组织MMP-2活性较对照组下降。结论:白蛋白过载的大鼠肾纤维化模型模型构建成功。白蛋白过载的早期,小管上皮细胞受刺激表达Rab7增加,长期白蛋白过载的大鼠肾组织Rab7表达下降、MMP-2活性下降、胶原沉积、自噬减弱。第三部分Rab7在白蛋白致肾小管上皮细胞急性损伤中的作用目的:探讨Rab7在白蛋白过载的肾小管上皮细胞急性损伤过程中是否参与MMP-2活性调控以及自噬在MMP-2活性调控中的作用。方法:制备白蛋白纳米球,以构建白蛋白过负荷的细胞模型,将Rab7导入HK-2细胞,构建Rab7过表达的稳转细胞株。激光共聚焦显微镜及透射电镜观察肾小管上皮细胞内吞及自噬情况。用WB和免疫组织化学染色检测LC3(47)、P62及MMP-2活性调控相关分子的表达。明胶酶谱法检测MMP-2的活性。此外,检测组织蛋白酶B的蛋白表达及活性,酸性磷酸酶的活性。免疫荧光检测EMT的发生。流式细胞术检测凋亡的发生。并且用自噬抑制(氯喹,CQ)进一步研究自噬在其中的作用。结果:白蛋白过载的肾小管上皮细胞MMP-2活性增强,溶酶体功能受损,自噬流受阻,细胞膜表面的MMP-2相关活性调控分子改变。当上调Rab7后,MMP-2活性下降,应用氯喹后,呈现相反变化。且上调Rab7后,EMT和凋亡减少。结论:Rab7在白蛋白过载的肾小管上皮细胞急性损伤中表达增加,并通过抑制MMP-2活性而发挥保护性作用。自噬参与白蛋白过载的肾小管上皮细胞MMP-2活性调控。第四部分Fe3O4磁性白蛋白纳米颗粒在白蛋白致小鼠肾小管上皮细胞损伤及纤维化中的作用目的:基于前期发现白蛋白包裹的Fe3O4磁性纳米颗粒可提升MMP-2活性,本研究将制备好的磁性白蛋白纳米颗粒应用于白蛋白过载的野生型小鼠及Rab7过表达的转基因小鼠模型,观察其对MMP-2活性、肾小管损伤、间质纤维化的影响,进一步探讨Rab7对MMP-2活性的调控规律。方法:化学沉淀法制备制备白蛋白包裹的Fe3O4磁性纳米颗粒,用聚乙烯亚胺(PEI)修饰其表面,以戊二醛交联方式,将牛血清白蛋白(BSA)包裹在Fe3O4磁性纳米颗粒外面。经电镜(TEM)、动态光散射分析仪(DLS)对其表征。对C57野生型小鼠和Rab7过表达的转基因小鼠尾静脉注射阳离子白蛋白,构建白蛋白过载的小鼠动物模型。造模结束后,继续尾静脉注射白蛋白包裹的Fe3O4磁性纳米颗粒。收集小鼠24h尿液测尿蛋白含量、尿NAG指数。小鼠心脏采血取血清测白蛋白、肌酐和尿素氮。取小鼠肾脏组织进行常规HE染色、天狼猩红染色、免疫组织化学染色检测a-SMA的表达。电镜观察小鼠肾脏超微结构,及内吞、自噬情况。明胶酶谱法检测小鼠肾组织MMP-2的活性。WB检测Beclin1、LC3(47)的表达。结果:电镜下观察白蛋白包裹的Fe3O4磁性纳米颗粒可见磁性白蛋白纳米颗粒直径约100nm,近似球形,大小均匀,分散性良好。白蛋白过载的野生型小鼠和Rab7过表达的转基因小鼠24小时尿蛋白含量和尿NAG均高于正常对照组。使用白蛋白包裹的Fe3O4磁性纳米材料后下降。但Rab7过表达的转基因小鼠检测结果高于野生型小鼠。血清生化检测结果与之相一致。HE染色结果显示:白蛋白过载的野生型小鼠和Rab7过表达的转基因小鼠肾小管间质有炎细胞浸润,小管水肿,蛋白管型和成纤维细胞增生,应用材料后减轻。但Rab7转基因小鼠病变程度较野生型小鼠重。天狼猩红染色和a-SMA的免疫组化结果显示,白蛋白过载的野生型小鼠和Rab7过表达的转基因小鼠肾小管间质阳性表达较强,应用材料后阳性表达减弱,且野生型小鼠比Rab7转基因小鼠表达更弱。明胶酶谱法检测结果是白蛋白过载的野生型小鼠和Rab7过表达的转基因小鼠肾脏MMP-2活性降低,应用材料后其活性增强,但Rab7转基因小鼠肾脏的MMP-2活性较野生型小鼠弱。接着我们用WB检测了小鼠肾组织中Beclin1、LC3(47)的表达,结果显示:白蛋白过载的野生型小鼠和Rab7过表达的转基因小鼠肾组织中Beclin1和LC3(47)的表达下降,应用材料后其表达增强,但Rab7过表达的转基因小鼠肾组织的Beclin1和LC3(47)的蛋白水平较野生型高。结论:成功制备了白蛋白包裹的磁性纳米材料并利用C57野生型小鼠和Rab7转基因小鼠成功构建了白蛋白过载的肾纤维化模型。在蛋白尿晚期,肾小管上皮细胞MMP-2活性降低,肾小管损伤加重,白蛋白包裹的磁性纳米材料有利于增强MMP-2活性,减轻白蛋白过载引起的肾纤维化。若长期蛋白尿,且Rab7过表达,可使MMP-2活性进一步下降,促进小管间质纤维化的发展。