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背景宫颈癌(cervical cancer CC)是指发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤。在中国,宫颈癌是比较多见的多发的妇科恶性肿瘤,排行榜首,并且发病群体日趋年轻化。大量研究表明,宫颈癌是由人乳头瘤病毒(HPV)持续感染引起的,此病毒可以直接通过皮肤接触传播,并且可在人体内潜伏十几年,所以早期可以没有任何的临床表现。随着病情的不断进展,患者可表现出异常阴道流血的症状。目前治疗方法主要是以手术治疗,放、化疗和中西医结合治疗为主的综合治疗,但中晚期及复发转移的患者的治疗效果却差强人意。手术后容易发生复发、转移,患者生存率不理想,而且也会给病人带来伤害和痛苦。因此,尽早研究出一种新的宫颈癌诊疗途径和方法是摆在我们面前的一个重要而迫切的任务。近年来,随着生物科学技术的不断发展和进步,蛋白质组学自提出后就得到了飞速的发展。蛋白质组学是从整体水平上研究细胞或组织内,在特定的空间和时间内,所有蛋白质的组成以及它们之间相互作用规律的学科。按蛋白质组学研究的内容分可以分为以下两种:细胞图谱蛋白质组学和表达蛋白质组学。前者着重研究蛋白质之间的相互作用规律,以便了解细胞间信号转导通路的复杂机制。后者则主要研究在不同的机体状态下,细胞或组织中所有蛋白质的表达及其变化。蛋白质组学研究的出现提示了人类对生物学的研究已经进入了后基因时代。后基因时代是以蛋白质组为主要研究对象,从整体的角度,分析细胞内部蛋白质的组成及其动态变化和其活动的规律。然后在建立正常的蛋白质表达指纹图谱的基础之上,通过对正常机体内的血清和患者血清内的蛋白质组进行比较分析,从而筛选出与疾病相关的特异性蛋白质。而这些特异性蛋白不仅可以做为某种疾病早期诊断的蛋白标记物,同时也可做为新药研发的分子靶点。另外,通过对血清的特异性蛋白质标志物的结构和功能的研究,也可以发现疾病发生发展的病理生理学机制。因此,目前筛选特异性蛋白标志物和探索药物分子靶点的有效办法就是对其蛋白质组学进行研究。在前期实验研究中,依托表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术对小儿肾母细胞瘤患儿血清与正常对照组患儿血清之间进行对比检测,筛选出小儿肾母细胞瘤患儿血清中存在的与正常儿童血清有差异的蛋白质。使用凝胶电泳(TRICINE-SDS-PAGE)技术对这些差异性蛋白进行筛选。通过基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)技术对分离纯化的蛋白质进行鉴定,最终确定为M/Z 6455.5Da的多肽。本次实验研究中主要研究M/Z 6455.5Da的多肽对宫颈癌细胞的作用和影响;通过细胞间接免疫荧光实验技术对M/Z 6455.5Da的多肽进行追踪;通过细胞毒性实验评价M/Z 6455.5Da的多肽对宫颈癌的干预效果;通过蛋白免疫印迹技术分析M/Z 6455.5Da的多肽干预过后提取的目的蛋白在宫颈癌细胞中的表达量变化,间接地观察宫颈癌细胞增殖的状态;通过流式细胞术测定宫颈癌细胞周期及凋亡情况,进一步探讨并验证M/Z 6455.5Da的多肽对宫颈癌细胞增殖的影响。对M/Z 6455.5Da的多肽的干预效果的监测、评价及其作用机制的研究奠定基础,为宫颈癌的后续治疗方案提供了新的研究方法和思路。目的研究并鉴定M/Z 6455.5Da的多肽对宫颈癌细胞的作用与影响,为进一步研究M/Z 6455.5Da的多肽对宫颈癌的作用机制奠定基础。材料与方法材料宫颈癌细胞:Hela细胞株、Siha细胞株。正常细胞:7702肝脏细胞株。以上细胞均购于中科院上海细胞库。方法1.细胞间接免疫荧光技术使用不同浓度的带有FITC荧光素标记的M/Z 6455.5Da的多肽分别处理Hela细胞、Siha细胞和7702细胞,用细胞间接免疫荧光技术呈现经M/Z 6455.5Da的多肽干预后的细胞形态,并对M/Z 6455.5Da的多肽进行追踪定位。2.细胞毒性试验—CCK8试验使用不同浓度的M/Z 6455.5Da的多肽分别处理Hela细胞、Siha细胞,用Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)法检测并描绘宫颈癌细胞的生长曲线,评价M/Z6455.5Da的多肽对宫颈癌细胞的增殖的作用。3.流式细胞术将Hela细胞、Siha细胞分别制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化丙啶PI)染色后,分析宫颈癌细胞的DNA含量。从DNA的含量中可反映细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。使用流式细胞仪计算出宫颈癌细胞中不同时相的肿瘤细胞的比例,根据不同浓度的M/Z 6455.5Da的多肽干预前后处于各个时相细胞比例的变化,可以对M/Z 6455.5Da的多肽的治疗效果进行监测,并指导后续的治疗方案。将膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)与PI染色联合使用,可以检测出早期凋亡的细胞,同时鉴定死细胞(包括凋亡细胞及坏死细胞)和活细胞。根据不同浓度的M/Z 6455.5Da的多肽干预后这早期凋亡细胞的变化,可以对M/Z 6455.5Da的多肽的作用机制的进一步研究奠定基础。4.蛋白免疫印迹技术提取出经不同浓度的M/Z 6455.5Da的多肽干预过的Hela细胞、Siha细胞中的目的蛋白,再经过聚丙烯酰胺凝胶分离并将目的蛋白转移至硝酸纤维膜,然后将膜片与特异的抗体作用,抗体与膜片上的蛋白的条带结合后,用二抗进行作用,后用发色底物显色。通过蛋白免疫印迹术分析硝酸纤维膜上着色的位置和着色深度分析目的蛋白在宫颈癌细胞中的表达情况。结果1.宫颈癌细胞的细胞间接免疫荧光结果M/Z 6455.5Da的多肽在不同浓度及特定的作用时间下,均可与Hela细胞和Siha细胞相作用,并且呈时间-浓度依赖效应关系(P<0.05)。M/Z 6455.5Da的多肽在不同的浓度及特定的作用时间下均不与7702细胞相作用(P>0.05)。2.宫颈癌细胞的细胞毒性实验结果M/Z 6455.5Da的多肽在不同浓度及特定的作用时间下,对Hela细胞和Siha细胞的增殖均有抑制作用,并且呈时间-浓度依赖效应关系(P<0.05)。3.宫颈癌细胞的周期与凋亡的结果在细胞周期中,随着M/Z 6455.5Da的多肽浓度的增加,宫颈癌细胞的S期细胞比例增加,表明阻滞了宫颈癌细胞周期的S期,与M/Z 6455.5Da的多肽的浓度呈浓度依赖效应(P<0.05);在细胞凋亡检测中,随着M/Z 6455.5Da的多肽的浓度的增加,Hela细胞和Siha细胞中凋亡的细胞逐渐增多,且与M/Z6455.5Da的多肽的浓度呈浓度依赖效应(P<0.05)。4.蛋白免疫印迹技术中目的蛋白表达的结果随着M/Z 6455.5Da的多肽浓度的增加,Hela细胞、Siha细胞中PCNA的表达逐渐减少,与M/Z 6455.5Da的多肽的浓度呈负相关(P<0.05)。结论M/Z 6455.5Da的多肽可抑制宫颈癌细胞的生长并可诱导宫颈癌细胞发生凋亡,对进一步研究M/Z 6455.5Da的多肽对宫颈癌的作用机制的研究及临床治疗具有重要的指导意义。