汉坦病毒(Hantavirus，HV)归属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，是有包膜分节段的负链RNA病毒，病毒基因组由长(L)、中(M)、短(S)三个单股负链RNA片段组成，分别编码RNA聚合酶(RNA polymerase)，G1、G2糖蛋白(Glycoprotein，GP)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)。人感染汉坦病毒后导致肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒肺综合征(HPS)两种严重的病毒性疾病。我国流行的是HFRS，每年报告病例占全球90％以上，报告发病人数2～5万人。该病在我国分布范围广、疫区类型复杂，已成为危害人民健康和生命安全的重点防治传染病之一。天津地区的HFRS发病率从1999年开始明显上升，是全国发病增长速度最快的地区之一，2002年HFRS的报告发病率达到4．05／10万，为天津市HFRS发病的历史最高水平。为了解天津地区HFRS病原体——汉坦病毒的流行型别、核苷酸序列特征及其进化关系，本研究对天津地区人群感染和鼠间传播的汉坦病毒进行分子流行病学分析；并且鉴于汉坦病毒G2包膜糖蛋白的重要研究地位，本研究在对汉坦病毒L99株G2蛋白进行了全面生物信息学分析的基础上，构建了G2多表位抗原基因mea，并对其进行了表达和蛋白纯化，并建立MEA-ELISA方法用于病人检测。第一部分天津地区汉坦病毒的分子流行病学分析【目的】针对近年来天津地区肾综合征出血热(HFRS)的疫情形势，对宿主动物传播和HFRS病人感染的HV进行了系统的分子流行病学研究，同时对HFRS患者的早期实验室检测和宿主动物标本的检测进行了方法学研究。【方法】(1)收集16份临床诊断HFRS患者血清，分别用间接免疫荧光方法(IFA)和捕获ELISA方法检测特异性IgG和IgM，用RT-Nested PCR方法检测汉坦病毒核酸并分型，用核苷酸序列测定和生物信息学分析进行同源性比对和种系进化分析。(2)采集天津地区的243份鼠肺标本，用rNP抗体-IFA法检测HV抗原，选取阳性鼠肺标本进行病毒RNA提取和RT-Nested PCR分型。用核苷酸序列测定和生物信息学分析进行同源性比对和种系进化分析。同时，将人群感染的HV与鼠间传播的HV进行序列同源性分析。(3)将HTN型HV感染的鼠肺接种Vero-E6细胞，进行病毒分离，通过RT-PCR和T-A克隆获得其S和M全基因片段，进行核苷酸序列分析、同源性分析和种系发生分析。【结果】(1)16例HFRS患者中，用捕获ELISA法检测特异性IgM的阳性率为52．65％(9／16例)，用IFA法检测特异性IgG的阳性率为52．65％(9／16例)，有11例RT-Nested PCR结果呈阳性，阳性率为68．75％，并且均为SEO型，并且相互间序列同源性为93．7％～100％。(2)rNP抗体-IFA法检测243份鼠肺标本，10份为阳性，阳性率为4．12％，10份阳性标本经RT-Nested PCR分型，有9株为SEO型，1株HTN型。并且9株SEO型HV的同源性为95．4％～100％。(3)天津地区人群感染与鼠间传播的汉坦病毒M片段的序列(1343～1629 nt)同源性分析发现，源自鼠肺组织的BC0207株与源自HFRS患者的1yf、ssg和hcy株的序列同源性为100％。(4)病毒分离获得HTN型汉坦病毒TJJ16株，其S片段与HTN型Q32毒株的核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为96．1％和97．9％，其M片段与Q32株的核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为99．4％和99．6％；【结论】天津地区人群感染和鼠间传播的HV分子流行病学研究表明均以SEO型为优势流行型，并具有明显区域聚集性特征。首次在社鼠体内分离到1株HTN型毒株TJJ16，与贵州的黑线姬鼠分离株Q32属同一亚型。第二部分汉坦病毒GP多表位抗原基因的构建与表达【目的】构建L99株G2蛋白的多表位抗原基因mea，并进行大肠杆菌表达和纯化，建立MEA-ELISA方法用于HFRS患者特异性抗体的检测。【方法】(1)通过生物信息软件对汉坦病毒L99株M基因及其编码的G2包膜糖蛋白进行了全面综合分析，并从亲水性和表面可及性，抗原性和蛋白二级结构四个方面对其B细胞表位进行分析预测，优选出B细胞表位，引入GPG(甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸)间隔序列将表位串联，设计出G2蛋白的多表位抗原基因mea。(2)利用重叠PCR方法构建mea，并利用pET原核系统表达以获得多表位抗原蛋白MEA，并进行镍亲和层析纯化。(3)利用真核表达载体pcDNA3．1(+)构建L99株G2蛋白的真核表达重组质粒，并经脾和肌肉复合DNA免疫BALB／c小鼠，以获得针对HV G2蛋白抗血清，用IFA法检测抗体效价，用免疫酶细胞化学技术检测抗体特异性。(4)利用G2蛋白抗血清对MEA进行特异性鉴定，并建立MEA-ELISA方法用于临床HFRS患者和健康人特异性抗体的检测。【结果】(1)优选出HV G2蛋白的5个B细胞表位，并构建了长度为534 bp的多表位抗原基因。(2)构建了重组蛋白表达质粒pET32a-mea，对多表位抗原基因mea进行了表达和纯化，获得了纯度为95％的多表位抗原MEA蛋白，得率为0．14mg／mL。(3)构建了真核表达质粒pcDNA3．1-L99G2，并DNA免疫BALB／c小鼠，获得了针对HV G2蛋白的抗血清，抗体效价1：80，质粒转染后胞内产生的瞬时表达G2蛋白证实其抗体特异性。(4)对多表位抗原MEA的抗原性研究表明，DNA免疫抗血清与多表位抗原MEA反应阳性，与重组N蛋白(rNP)反应阴性。(5)MEA-ELISA方法检测30例HFRS患者IgG的阳性率为76．67％，检测10例健康人IgG全部为阴性。【结论】首次构建了汉坦病毒GP的多表位抗原基因，并进行pET原核表达系统表达，获得了多表位抗原MEA，具有高度特异性，可替代HV G2蛋白用于HFRS临床患者特异性抗体的检测，并为构建新型表位疫苗奠定基础。