荧光成像技术作为一种可以在无损条件下可视化探究生命活动的手段,近年来得到了广泛的关注。双光子荧光显微镜因拥有背景荧光低,光致损伤小,样品穿透深度大,成像观测时间长等其它成像方法无法比拟的优势已经成为了荧光成像不可或缺的工具。双光子荧光探针作为成像过程中荧光信号的承担者在双光子成像过程中起着至关重要的作用,在目前已报道的众多双光子成像的材料中,基于有机小分子构建的双光子荧光探针因具有细胞穿透能力强,成像速度快,特异性强,易修饰等特点得到了蓬勃的发展。本文基于萘酰亚胺骨架设计并合成了双光子荧光探针Z1-Z4,分别实现了对生物体内的氟离子,含有巯基的生物小分子,亚硝酸根以及一氧化氮的检测和成像,具体工作如下:1.首先,我们基于分子内电荷转移(intramolecular charge transfer,ICT)机理构建了双光子比率荧光氟离子探针Z1,探针以萘酰亚胺为荧光骨架,叔丁基二苯基硅烷为识别基团。探针与氟离子作用以后,由于氟与硅的亲和作用,Si-O键被切断,探针的荧光发射由蓝色(450 nm)红移至绿色(550 nm),从而实现对氟离子的特异性识别,Z1可以成功的应用于细胞和组织(250μm)中氟离子的双光子比率荧光成像。2.随后,我们基于光致电子转移(photo-induced electron transfer,PET)的机理,设计了双光子off-on巯基小分子探针Z2,通过哌嗪连接荧光团萘酰亚胺与识别基团2,4-二硝基苯磺酰基。探针Z2对含有巯基的小分子有良好的选择性,并且展示出剧烈的荧光增强,同时探针具有良好的生物相容性和稳定性(pH7.2–8.4),可以成功的应用于细胞和组织内(50-250μm)的巯基双光子成像。3.在上一个工作的基础上,我们以顺丁烯二酸酐作为识别基团设计了双光子巯基探针Z3(ortho-Z3,meta-Z3,para-Z3),通过顺丁烯二酸酐与巯基的加成反应实现对巯基的检测。探针以光致电子转移为构建机理,通过识别基团与荧光团之间的邻间对的位置分布,研究位置异构对光致电子转移效率的影响。实验结果表明,邻位取代的探针o-Z3与间位和对位取代的异构体相比,具有更高的光致电子转移效率,同时,探针o-Z3可以被成功的应用于血浆中巯基含量的测定和细胞中的内源性巯基成像。4.通过以上工作的积累,我们设计了可以对亚细胞结构线粒体内的NO进行成像的双光子比率荧光探针Z4,实验结果表明,探针Z4可以对亚硝酸根进行定量测试,同时可以对NO进行识别,探针Z4被成功的应用于实际样品中的亚硝酸根含量检测和线粒体中NO的比率荧光成像。