支气管哮喘是一种由多种因素引起的，以可逆性气道阻塞、气道高反应性和气道炎症为特征的变态反应性疾病。目前全世界约有3亿哮喘患者，患病率大约以每年1％的速度递增，尤其以儿童哮喘的患病率上升显著。现有的治疗方案包括糖皮质激素、支气管扩张剂、白三烯调节剂等并不能满足部分哮喘患者的治疗需求，每年死于哮喘病的患者有18万之多，而且近期哮喘的死亡率在世界范围内均呈直线上升。哮喘的发病机制非常复杂，目前的观点认为IgE介导的肥大细胞被激活所致的Ⅰ型超敏反应是哮喘发病的重要因素。机体在暴露于抗原后，树突状细胞与CD4+T细胞相互作用并导致Th2型细胞因子的产生，促使B细胞生成IgE并通过肥大细胞表面与IgE抗体Fc段呈高亲和力的受体(FcεRI)结合，使机体处于对该抗原的致敏状态。当相应抗原再次进入机体时通过与致敏肥大细胞表面两个或两个以上相邻IgE抗体特异性结合，使膜表面FcεRI交联活化并最终导致肥大细胞脱颗粒并导致后续的炎症反应。目前认为β-氨基已糖苷酶是监测肥大细胞脱颗粒释放的标志。　　 钙离子在肥大细胞活化后的脱颗粒反应起重要作用。当FcεRI受体激活后，细胞内钙离子浓度呈双相升高，最初的短暂的钙离子浓度升高目前机制已较明确，主要通过生成三磷酸肌醇使存储在内质网的Ca2+释出，升高胞浆Ca2+水平。但这个过程钙离子浓度呈一过性的升高，是一个瞬时变化，并不能满足细胞的持久反应，随后持续的胞内钙离子浓度升高才是肥大细胞参与病理生理活动的关键。但是，究竟哪些离子通道介导了钙离子内流目前尚未完全明确。　　 兴奋性细胞的钙离子内流主要依靠电压操纵性钙通道。但是作为非兴奋性细胞，肥大细胞缺乏电压操纵性钙通道。瞬时感受器电位通道(TRP)为钙库操控性钙离子内流(SOCE)通道，包括7个亚家族，其中TRPM亚家族含有8个成员(TrM1-TRPM8)，因其作为与钙离子转运有关系的通道一直为学者们所关注。瞬时感受器电位M7(TRPM7)是TRPM的重要成员之一，有研究表明它可介导钙离子和镁离子内流，消除DT-40 B淋巴细胞的TRPM7立即引起细胞成长停止和死亡，显示TRPM7引起的钙流入对该细胞的存活起关键作用；最近的研究表明TRPM7在人类肥大细胞上有表达并对肥大细胞存活有重要作用。因此，TRPM7有可能是肥大细胞上一个重要的介导钙离子内流的通道。　　 因此，本研究选择大鼠RBL-2H3细胞作为研究对象，首先检测RBL-2H3细胞TRPM7通道的表达及表达部位，然后再构建TRPM7-siRNA逆转录病毒载体，通过TRP通道阻断剂2-APB抑制TRPM7功能及逆转录病毒介导的RNA干扰下调TRPM7表达，观察TRPM7通道在RBL-2H3细胞的存活、凋亡以及抗原活化中的作用，初步研究RBL-2H3细胞TRPM7的功能，为揭示TRPM7通道参与肥大细胞病理生理活动提供坚实的研究基础。　　 第一章瞬时感受器电位M7通道在RBL-2H3细胞的表达　　 研究目的：　　 明确TRPM7通道在RBL-2H3细胞的表达情况。　　 研究方法：　　 RT-PCR检测RBL-2H3细胞TRPM家族mRNA的表达；Western blot检测RBL-2H3细胞TRPM7蛋白的表达；细胞免疫荧光检测TRPM7通道在RBL-2H3的表达部位。　　 结论：　　 TRPM7通道表达于在RBL-2H3细胞并主要位于细胞膜。　　 第二章TRPM7-siRNA逆转录病毒载体的构建　　 研究目的：　　 构建携带大鼠TRPM7-siRNA的逆转录病毒载体。　　 研究方法：　　 设计3个TRPM7-siRNA序列和1个无关对照序列，克隆到酶切的pSuper-retro-neo-GFP逆转录病毒载体。重组质粒采用脂质体Lipofectamine2000转染RBL-2H3细胞，通过Western blot检测干扰效率。筛选出最有效的pSuper-retro-neo-GFP-siTRMP7与包装质粒共转染293FT细胞生成逆转录病毒；逆转录病毒感染RBL-2H3细胞，荧光实时定量PCR及Western blot检测TRPM7-siRNA的沉默效果。　　 结论：　　 成功构建大鼠TRPM7-siRNA逆转录病毒载体，为研究TRPM7的功能提供了有力的工具。　　 第三章瞬时感受器电位M7通道在RBL-2H3细胞的功能研究　　 研究目的：　　 明确TRPM7通道在RBL-2H3细胞存活、凋亡及抗原活化的作用。　　 研究方法：　　 1、以TRP通道阻断剂2-APB抑制TRPM7功能及TRPM7-siRNA逆转录病毒载体转染RBL-2H3细胞，通过MTT、流式细胞术以及TUNEL-FITC/Hoechst33258检测比较不同处理后RBL-2H3细胞数及凋亡率的变化及差异，观察TRPM7通道在RBL-2H3细胞存活及凋亡的作用；　　 2、以DNP-IgE致敏过夜后再用抗原DNP-BSA激活RBL-2H3细胞，测定β-氨基已糖苷酶的含量及细胞内钙离子浓度变化；以TRP通道阻断剂2-APB抑制TRPM7功能及TRPM7-siRNA逆转录病毒载体转染RBL-2H3细胞后观察对RBL-2H3细胞β-氨基已糖苷酶的含量及细胞内钙离子浓度的影响。　　 结论：　　 1、TRPM7参与RBL-2H3细胞存活及凋亡过程。　　 2、TRPM7可能作为介导晚期外钙内流的离子通道参与了RBL-2H3细胞的脱颗粒过程。