背景结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,近年来由于外科手术切除、放疗、化疗等联合治疗,结直肠癌的5年生存率有所提高,但是有近50%病人最终发生转移,而转移性结直肠癌是病人死亡的主要原因；基于传统治疗在结直肠癌中的作用有限,为了提高疗效,降低药物毒性,靶向治疗药物应运而生。表皮生长因子受体(EGFR)是受体酪氨酸激酶家族成员之一,在多种重要的信号通路中扮演重要角色,并在多种肿瘤中如头颈癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌等均有异常表达,EGFR与配体结合后将触发多种信号通路,包括Ras/Raf-1/MAPK、PI3K/AKT,其可促进细胞增殖、细胞周期进程和细胞抗凋亡。82%的结直肠癌患者有EGFR的过表达。西妥昔单抗就是靶向表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体,它能够抑制细胞的生长、增殖与转移。有研究显示西妥昔单抗联合细胞毒性化疗药物能够改善KRAS野生型转移性结直肠癌患者的治疗疗效,也就是说西妥昔单抗仅仅适用于KRAS野生型的结直肠癌患者,然而仍有40%的KRAS野生型的结直肠癌患者治疗无效或对其耐药。因此探索新的结直肠癌早期诊断生物标志物及治疗靶分子迫在眉睫。MicroRNA (miRNA)是一类内源性的非编码小分子单链RNA,通过靶向mRNA的3’非翻译区,负性调控基因的表达,在许多生物过程中包括细胞周期、分化、增殖、凋亡或侵袭性等发挥重要的生理作用。许多miRNA有抑制肿瘤或促进肿瘤形成的作用,在肿瘤形成的过程中扮演重要角色,同样也影响着抗肿瘤治疗的疗效。因此,miRNA可能成为强有力的治疗药物或治疗靶点。研究发现miR-21在多种恶性肿瘤中表达上调,包括食管癌、乳腺癌、胃癌、胆管癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌等,被认为是致癌miRNA。有研究发现miR-21通过介导成瘤性的EGF/RAS信号通路促进肿瘤的形成,也就表明miR-21可能通过调控RAS信号通路,参与细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等病理生理过程,同时在抗肿瘤药物耐药性方面也发挥着重要作用。因此我们将探讨miR-21对结肠癌细胞的生物学功能及对西妥昔单抗药物敏感性的影响。目的通过构建上调、下调miR-21的慢病毒载体并包装成慢病毒,然后转染人结肠癌细胞RKO,检测上/下调miR-21对结肠癌细胞生物学作用及对西妥昔单抗敏感性的影响,探讨miR-21在结肠癌发生发展及耐药性中的可能作用,为进一步阐明结肠癌发生发展过程中的分子机制提供思路,为寻找结肠癌早期诊断与治疗新靶点提供理论依据。方法1、分别合成hsa-miR-21及hsa-miR-21-inhibition的上下游引物,引物经退火形成双链DNA目的片段,取目的片段及载体经EcoRI或AgeI/EcoRI进行酶切反应,37℃,1h；产物行凝胶电泳,采用天根生化公司的凝胶回收试剂盒回收经过酶切的载体和片段：收集琼脂糖凝胶中单一目的条带,50℃水浴10min充分溶解,将溶液转至吸附柱CA2中,离心弃废液,加入漂洗液洗脱DNA,然后采用碧云天公司的T4DNA Ligase试剂盒进行连接酶反应,22℃,1h；取大肠杆菌DH-5α新鲜感受态细胞与链接产物进行感受态的转化：冰上放置30min,42℃水浴中热休克90s,然后迅速置于冰上冷却3-5min,加入LB液体培养基后,于37℃水浴中温浴30mmin,使受体菌恢复正常生长状态；取适当体积转化后的感受态细胞涂板,37℃倒置培养16-24h；挑取菌斑作为模板行PCR反应：95℃3min—(94℃30s—60℃30s—72℃30s)×30个循环—72℃6min;取阳性菌落的PCR产物作为模板,使用美国ABI公司的BigDyeTerminator v3.1试剂盒进行测序PCR反应；取表达质粒、包装质粒及POLOdelivererTM3000Transfection Reagent共转染293T细胞进行慢病毒的包装；收集293T细胞上清液后离心,浓缩病毒液;采用梯度稀释法测定病毒滴度；慢病毒转染法转染目的细胞RKO细胞,在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况,初步估计慢病毒感染效率。2.人结肠癌细胞株RKO购自上海细胞库。培养条件如下：MEM-α培养基,添加10%澳洲胎牛血清,在37℃、5%CO2及适当湿度的无菌细胞培养箱中培养。取生长状态良好的对数生长期的转染了hsa-miR-21、hsa-miR-21-inhibition及其阴性对照慢病毒、空白对照的RKO细胞,采用Trizol法(Life Technologies公司)提取细胞总RNA,并测定RNA纯度及浓度。取纯度较好的RNA为模板,通过逆转录合成cDNA,反应条件：RNA变性：70℃,10min；冰上2min; cDNA的合成：42℃,60min;70℃,10min,共一个循环。取逆转录产物行荧光定量PCR反应,每份标本4个复孔,以U6为内参,在最佳反应条件下用定量PCR仪同时扩增并进行融解曲线分析,PCR反应条件为：95℃30s—(95℃10s—60℃20s—72℃30s)×45个循环。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线,获得CT值,CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。采用2-△△CT法对数据进行分析。ACT即目的基因CT值减去内参U6CT值。AACT即实验组ACT值减去对照组ACT。3.取生长状态良好的对数生长期的转染了has-miR-21、hsa-miR-21-inhibition及其阴性对照慢病毒、空白对照的RKO细胞,常规胰酶消化后行细胞计数,按每孔1×104个细胞接种到96孔板,每孔体积100μL,每组设置6个复孔,分别接种4块板,于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,培养后24h、48h、72h、96h分别加入MTT溶液(5mg/mL)20μL/孔,继续孵育4h,小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μL DMSO,室温振荡10min,使结晶物充分溶解；于490nm波长处测定各孔OD值。以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。4.配置1.2%和0.7%两个浓度的无菌低熔点琼脂液体,高压灭菌后40℃维持,使之保持溶解状态。按1：1混合1.2%的琼脂糖和2×完全培养基,按每孔20mL混合液注入6孔板中,待冷却凝固,备用。收集对数生长期的上调/下调miR-21、阴性对照及空白对照的RKO细胞,制成10000活细胞/mL的细胞悬液；按1：1比例将0.7%琼脂和2×完全培养基在无菌试管中混合后,取1mL混合液+0.1mL单细胞悬液(1000个细胞/孔),充分混匀、注入已铺有底层琼脂的培养板中,在室温放置20min使细胞琼脂悬液凝固。将六孔板置于C02培养箱中37℃进行培养。培养10d后,观察细胞克隆形成情况并计数。5.采用RIPA法提取上调/下调miR-21、阴性对照及空白对照的RKO细胞的蛋白,加入loading buffer后,95-100℃水浴变性5-10min,冰上冷却。取适量Marker及蛋白质样品,行SDS-PAGE电泳,分离蛋白：60V恒压,30min;120V,60min;再以恒流300mA,3h将蛋白转移到PVDF膜上,脱脂奶粉封闭1h,加入一抗AKT抗体(1:1000), P-AKT抗体(1：2000),Raf-1抗体(1：1000),P-actin抗体(1：2000),4℃孵育过夜,反复洗膜；再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1：2000)室温孵育1h,反复洗膜后,加入ECL发光液,进行曝光、显影、定影,最后扫描胶片进行灰度值分析。6.取对数生长期的上调/下调miR-21、阴性对照及空白对照的RKO细胞,常规胰酶消化后,行细胞计数,按照每孔1×104个细胞接种到96孔板,于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24h后,加入300μg/mL的西妥昔单抗溶液200μL,不同细胞设置3个复孔,培养24h后,弃培养液,每孔加入100μL无血清培养基及10μL CCK-8,37℃、5%CO2及饱和湿度条件下继续培养,每隔30min用酶标仪在波长450nm波长处测定吸光度OD值,直至未加药孔的OD值为1.0-1.2时为最佳时间,终止反应。细胞抑制率=1-(实验孔OD值-空白孔OD值)/(未加药孔OD值-空白孔OD值)×100%。7.统计方法对正态分布的连续性变量采用(x±s)描述,非正态分布的数据采用中位数(四分位数间距)描述。采用One-way ANOVA分析比较上调/下调miR-21、阴性对照及空白对照的RKO细胞后miR-21表达水平之间的差异；采用两个重复测量因素的方差分析比较上调/下调miR-21、阴性对照及空白对照的RKO细胞24h组、48h组、72h组、96h组细胞增殖能力之间的差异；采用One-way ANOVA分析比较上调/下调miR-21、阴性对照及空白对照细胞的克隆形成能力之间的差异；采用One-way ANOVA分析比较上调/下调miR-21、阴性对照及空白对照细胞西妥昔单抗药物抑制率之间的差异；当满足方差齐性时采用LSD法比较组间差异,当不满足方差齐性时采用Dunnett T3法比较组间差异；P<0.05表示有统计学意义,采用SPSS13.0软件进行统计分析。结果1. hsa-miR-21、hsa-miR-21-inhibition慢病毒载体的构建、包装及转染目的细胞我们在慢病毒载体构建时采用酶切、电泳跑胶、纯化、链接、感受态细胞的转化及涂板、PCR鉴定等实验步骤,最终挑选阳性克隆进行测序鉴定,hsa-miR-21、hsa-miR-21-inhibition测序结果与实验要求的DNA序列一致,将构建好的慢病毒干扰质粒转染到293T细胞中,包装产生重组慢病毒颗粒,通过观察绿色荧光,可见90%以上的细胞带有绿色荧光。收集浓缩病毒颗粒后测定LV-miR-21、LV-anti-miR-21、LV-miR-21NC、LV-anti-miR-21NC细胞的病毒滴度分别为：3.0E+9TU/mL、2.0E+9TU/mL、6.0E+8TU/mL、8.0E+8TU/mL;将病毒颗粒分别感染人结肠癌RKO细胞,观察绿色荧光,感染效率在80%以上。2.miR-21在不同慢病毒转染细胞中的表达上调/下调miR-21、阴性对照及空白对照细胞的miR-21表达水平有差异(P<0.05),其中LV-miR-21、LV-anti-miR-21细胞组的miR-21表达水平分别与其阴性对照组及空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05); LV-miR-21细胞的miR-21表达水平高于LV-anti-miR-21细胞(P<0.05)；而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。3.不同慢病毒转染细胞增殖能力的变化上调/下调miR-21、阴性对照及空白对照细胞在分别培养24h、48h、72h、96h的细胞增殖能力有差异(P<0.01),转染LV-miR-21后,随着时间的增长细胞的增殖能力明显增强,而转染LV-anti-miR-21后,随着时间的增长细胞的增殖能力明显降低。4.不同慢病毒转染细胞的克隆形成能力变化上调/下调miR-21、阴性对照及空白对照细胞的克隆形成数有差异(P<0.05),LV-miR-21细胞组的克隆形成数多于LV-anti-miR-21细胞(P<0.05)；LV-miR-21、LV-anti-miR-21细胞组的克隆形成数分别与其阴性对照组及空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。5.不同慢病毒转染细胞中相关信号通路下游蛋白的表达水平上调/下调miR-21、阴性对照及空白对照细胞的p-AKT、Raf-1表达水平有差异(P<0.05),其中LV-miR-21细胞组的p-AKT、Raf-1蛋白表达水平高于LV-anti-miR-21细胞组(P<0.05)。6.不同慢病毒转染细胞对西妥昔单抗敏感性的变化在300μg/mL西妥昔单抗药物浓度,上调/下调miR-21、阴性对照及空白对照细胞的细胞抑制率有差异(P<0.05),其中LV-anti-miR-21细胞组的细胞抑制率高于LV-miR-21细胞组,差异有统计学意义(P<0.05)；而阴性对照组与空白组之间的细胞抑制率无明显差异(P>0.05)。结论下调miR-21能够抑制RAS信号通路的活化,抑制结肠癌细胞RKO的增殖、克隆形成能力,增强细胞对西妥昔单抗的敏感性。MiR-21可能作为肿瘤miRNA,通过激活RAS信号通路,在结肠癌的发生发展及耐药性方面发挥重要作用。