川芎嗪联合顺铂对肺腺癌小鼠的抑瘤效果及其作用机制

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据2016年世界肺癌联盟数据显示,全球每年约160万人死于肺癌,肺癌已成为全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。我国也是世界上肺癌患者最多的国家,每年约73万人被确诊为肺癌。随着我国工业化高速发展导致雾霾现象日益严重和吸烟率的不断增加,肺癌的发病率在我国正迅速增加,已成为我国人口恶性肿瘤死亡原因的首要位置。随着医疗技术水平不断提高,其治疗方法逐渐多样化,目前肺癌治疗的手段有化学治疗、放射治疗、外科手术、微创治疗、免疫及中医药治疗等,但无论是采用哪种治疗方法并发症多、预后差,治疗的总体疗效并不乐观,因此寻求新的治疗方法迫在眉睫。恶性肿瘤的发生、生长、转移均依赖于血管生成,因此抑制血管新生即可抑制肿瘤的发展。调控肿瘤血管生成的关键在于血管生成促进因子和抑制因子,因此掌控二者的动态平衡成为治疗肿瘤至关重要的一步。趋化因子CXCL16(chemokine CXCL16)是近年发现的一种新的趋化因子,属于CXC型趋化因子家族,具有多种生物学活性,能介导细胞间黏附和血管生成。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)是目前公认的抗肿瘤作用最强的因子,既能与受体结合诱导肿瘤细胞凋亡,又能作用于肿瘤血管内皮细胞,导致血管功能紊乱,进而抑制肿瘤的生长。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是活血化瘀药川芎中分离得到的有效成分,具有抗肿瘤血管新生的作用,进而起到抗肿瘤作用,但机制有待进一步研究。顺铂(cis-diamminedichloroplatin,DDP)是第一个合成的铂类抗癌药物,结构简单,机理明确,是临床上常用的化疗药物之一。近年来国内许多学者研究表明,肿瘤化疗药物与血管新生抑制中药联合使用,能显著增加化疗药物的抗肿瘤疗效。本实验研究通过Lewis肺腺癌移植瘤模型的建立,研究川芎嗪、顺铂对各模型组小鼠体重、肿瘤体积、肿瘤重量及血管因子CXCL16和TNF-α表达的影响。旨在阐明川芎嗪和顺铂联合使用抗肿瘤血管生成的可能机制,探索有效的抗肿瘤药物,为未来抗肿瘤用药的新策略奠定实验理论基础。具体实验研究内容如下。建立小鼠移植瘤模型,培养Lewis小鼠肺腺癌细胞,选取对数期生长良好的细胞,将稀释好的细胞注射到5~6周龄健康雄性C57BL/6小鼠右腋皮下,接种细胞后14天,测量小鼠皮下肿瘤约8mm左右,将64只成瘤小鼠随机分组,共4组:生理盐水组(NS,0.9%NaCl),顺铂组(DDP,2mg·kg-1),川芎嗪组(TMP,100mg·kg-1),联合组(TMP+DDP,剂量同上),每组16只。接种后第14天开始按上述剂量腹腔注射给药,连续给药2周,每天观察小鼠精神状态,并测量皮下肿瘤长短径并计算肿瘤体积。给药结束24小时后引颈处死小鼠,将右腋皮下肿瘤剥离称瘤重并计算抑瘤率,同时将剥离瘤组织用固定液固定。采用透射电镜技术观察小鼠肿瘤组织结构、免疫组化SP法和酶联免疫吸附法分别检测CXCL16和TNF-α的表达情况。用药结束后,以生理盐水组小鼠为对照,通过观察小鼠的精神状况、活动情况、饮食状态、肿瘤大小及重量等指标,评价小鼠生存情况及化疗药物对小鼠毒副作用的影响。实验结果为:以生理盐水组为对照组,川芎嗪组小鼠一般生活情况较好,皮下肿瘤生长速度较快;顺铂组小鼠一般生活情况最差,精神不振、行动迟缓、毛色发黄、脱毛明显等现象,皮下肿瘤生长速度慢。联合用药组小鼠一般生活情况较顺铂组好,比川芎嗪组差,皮下肿瘤生长速度最慢。各模型组皮下肿瘤体积从大到小依次为:生理盐水组、川芎嗪组、顺铂组、联合组。各模型组皮下瘤重关系为:生理盐水组>川芎嗪组>顺铂组>联合组,抑瘤率分别为:川芎嗪组(21.69%)、顺铂组(40.74%)、联合组(61.11%),联合组抑瘤率最大,川芎嗪组抑瘤率较顺铂组差(P<0.05)。结果说明川芎嗪、顺铂二者均有抑制肿瘤生长的作用,川芎嗪较顺铂抑瘤作用差,川芎嗪联合顺铂抑瘤作用最强,二者存在协同增效作用。采用透射电镜观察各用药组肿瘤细胞发现:细胞膜缺损,内质网扩张及脱颗粒,线粒体形状异常,结构紊乱,细胞核增大,核仁碎裂,染色质趋边。顺铂组细胞超微结构改变程度明显大于川芎嗪组,联合组细胞改变最明显,细胞变圆,染色质凝聚、分块,胞质皱缩,出现内含胞质、细胞器及核碎片的凋亡小体,被周围细胞吞噬。免疫组织化学SP法检测CXCL16和TNF-α的表达结果显示:CXCL16在四组中均呈阳性表达,与生理盐水组(41.27±7.61)×103比较,川芎嗪组(26.31±3.67)×103、顺铂组(25.46±3.46)×103以及联合治疗组(16.59±4.39)×103表达明显减少,且联合治疗组表达最低,差异具有统计学意义(P<0.05)。TNF-α在四组中均呈阳性表达,与生理盐水组(12.78±5.14)×103比较,川芎嗪组(15.42±3.18)×103、顺铂组(16.16±3.69)×103以及联合治疗组(22.57±4.51)×103表达明显增加,且联合治疗组表达最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。酶联免疫吸附法检测CXCL16和TNF-α的表达结果显示:CXCL16在四组中均呈阳性表达,与生理盐水组(117.74±7.61)比较,川芎嗪组(102.78±6.12)、顺铂组(101.38±5.49)以及联合治疗组(80.94±5.78)表达明显减少,且联合治疗组表达最低,差异具有统计学意义(P<0.05)。TNF-α在四组中均呈阳性表达,与生理盐水组(54.69±7.45)比较,川芎嗪组(60.46±4.17)、顺铂组(61.39±1.02)以及联合治疗组(68.58±0.12)表达明显减少,且联合治疗组表达最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。采用免疫组化与酶联免疫吸附法检测CXCL16和TNF-α的表达,二者结果一致,表明川芎嗪、顺铂二者都能降低Lewis肺癌CXCL16的表达,并能够增加TNF-α的表达,二者联合用药能够进一步增强对CXCL16表达的抑制作用,以及对TNF-α表达的促进能力。综上所述,川芎嗪具有抗肿瘤生长的作用,与顺铂联合用药能增强化疗疗效并降低顺铂在化疗过程中的毒副作用。川芎嗪联合顺铂机制可能是通过上调TNF-α的表达,同时降低CXCL16的表达而发挥抗肿瘤的作用。
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