【摘 要】
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黄芪(Astragalus membranaceus)是我国主要的传统药用植物之一,具有广泛的临床应用基础。野生资源的匮乏、栽培品种道地性的丧失以及环境的恶化,使得应用生物技术方法获得品质
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黄芪(Astragalus membranaceus)是我国主要的传统药用植物之一,具有广泛的临床应用基础。野生资源的匮乏、栽培品种道地性的丧失以及环境的恶化,使得应用生物技术方法获得品质改良的黄芪可替代资源迫在眉睫。本文探讨了应用基因工程方法,采用转双基因技术来改变黄芪毛状根中有效成分含量的可行性。
本论文克隆了黄酮合成途径中的关键酶基因,并将克隆出的基因构建植物表达载体,成功构建出两个含双基因的中间载体,通过三亲杂交的方法将载体转入发根农杆菌,将该发根农杆菌侵染黄芪外植体,从而诱导出毛状根。在这个过程中,双基因载体同时将两个基因转入毛状根中。特异基因引物PCR筛选表明,转入的基因已经整合于阳性毛状根株系的基因组中。进一步使用HPLC的手段对阳性毛状根株系中的黄酮含量进行了测定。
得到的主要结果如下:
克隆获得黄酮代谢途径关键酶基因查尔酮合成酶chs、肉桂酸羟化酶c4h全长cDNA,经BLAST比较与GenBank中公布的全长cDNA一致。
成功构建双基因植物表达载体,并通过三亲杂交的方法得到含目的载体的发根农杆菌LBA9402。
诱导并继代培养出转基因毛状根。
通过特异基因引物PCR手段筛选出阳性株系。
使用HPLC对阳性毛状根株系中的毛蕊异黄酮成分进行了含量测定。
从HPLC含量测定的结果来看,转基因毛状根中的黄酮有效成分含量相比与原代毛状根中的含量有所减少,我们推测这个现象的出现与转基因导致基因沉默有关。
本论文的完成,将现代生物技术应用于传统中药材的研究中,探索了中药材现代化生产的新技术途径,并为今后定向提高根茎类药材的品质积累了数据,创造了思路,提供了可靠的技术与方法。
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