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霍乱是由霍乱弧菌引起的一种急性肠道传染病，由于发病急、传播快、波及面广、危害极为严重，因此其预防和控制受到各国政府的高度重视。在一些经济欠发达、卫生条件较差的地区，预防接种是进行霍乱防治较为有效的措施，但现有疫苗费用昂贵，贮存、运输相当困难，因此，研制成本低、使用简单、易于贮存运输的新疫苗是当前疫苗研究的一大热点。 植物基因工程技术的不断成熟为新型疫苗的研究提供了新的思路。转基因植物产生的疫苗，可由人体简单摄食含该种疫苗的植物组织，通过刺激机体粘膜的特异性免疫应答，使人体获得较持久的疾病防御能力。由于成本低廉、无需冷藏、无需一次性针头、使用方便，因此，“植物口服疫苗”得到了世界卫生组织(WHO)的提倡，开展这方面的研究对推动全球免疫计划的实施具有重要的意义。 本研究利用植物DNA重组技术，培育出只在番茄果实中特异、高效表达霍乱毒素B亚单位(CTB)的植物口服疫苗，为霍乱弧菌植物口服疫苗的应用研究及市场化提供实验基础。 首先，我们通过酶切、PCR等方法分别获取目的基因CTB和番茄果实特异性启动子——E8启动子基因片段，利用质粒pBlueScript(+)SK、T载体和PBI121上的酶切位点，构建启动子为E8的植物双元表达载体Pe8-CTB，以冻融法将其转至根癌农杆菌LBA4404中。 再通过正交设计实验，以番茄子叶为外植体，对所选用的番茄品种、子叶苗龄、植物激素浓度和培养温度等条件进行优化，结果表明，当选用穗丰品种、培养温度为27±1℃、BA=3.0 mg／L、IAA=0.1mg／L球少尹禅论丈时，芽的再生频率平均高达98.5%，每片子叶外植体的平均再生芽数达6.8个。 在高效再生系统的基础上，优化农杆菌稀释浓度、浸染时间和转化方式等条件。在子叶预培养2d、活化农杆菌稀释倍数约30倍、侵染时间为10min的情况下，子叶存活时间最长，抗性芽产生频率达25%。在此条件下，将CTB基因通过农杆菌浸染法对番茄细胞进行转化，筛选到30株抗性番茄幼芽。对这些抗性芽作伸长、生根诱导培养，其中26株长成番茄植株并开花结果。 对植物基因组DNA的PCR、dot blot和Southern印迹杂交，证实所获得的26株抗性植株中14株有CTB整合到番茄基因组DNA中。 提取转基因番茄植株不同部位组织、不同时期果实总的可溶性蛋白，进行ELISA检测和Western b10t杂交，结果表明其中2株的番茄果实有CTB的表达，表达量随着果实的成熟而升高，并在完全成熟果实中达到最高(455ng/g鲜重和385ng/g鲜重)，达到了当前国际上所报道的外源基因在番茄中表达的较高水平。 动物喂饲实验研究正在进行中。