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研究背景和目的:神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见的颅外实体瘤,目前国内对早期、低危NB已取得较好的治疗效果,但晚期NB,虽然结合运用了手术、大剂量化疗、放疗及自体干细胞移植等手段,患儿五年生存率仍维持在50%左右,单纯地加大手术、放化疗强度已经很难有效提高患儿的治疗效果,未来的治疗方向应该是更加特异性、敏感性的治疗手段—分子靶向治疗。因此,寻求新而有效的潜在NB分子靶点具有重要意义。EZH2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)蛋白是多梳抑制复合物2(polycomb repressor complex 2,PRC2)的核心催化元件,通过促使组蛋白H3甲基化对靶基因的转录起调控作用。研究显示,EZH2高表达是多种癌病预后不良的因素,在NB中,同样发现EZH2在表观遗传上沉默NB抑癌基因CASZ1、CLU、RUNX3和NGFR,提示EZH2可做为NB分子靶向的潜位点。本课题的研究目的在于检测EZH2蛋白在NB组织水平中的表达情况,并结合临床资料分析其表达水平与NB患儿临床病理因素和生存预后的关系,然后在NB细胞系中稳定过表达和降表达EZH2,进一步研究EZH2对NB发生发展的作用机制。研究方法和主要结果:1.EZH2在神经母细胞瘤组织中的蛋白表达情况方法:利用免疫组化的方法检测74例NB组织中EZH2的表达情况。结果:74例患儿中阴性表达EZH2 2例,弱阳性表达EZH2 21例,阳性表达EZH231例,强阳性表达EZH2 20例,即EZH2弱表达23例,强表达51例。2.EZH2表达与NB患儿临床病理特点及生存预后分析方法:利用SPSS19.0统计学软件分析EZH2表达情况与NB患儿临床病理因素之间和患儿生存预后的相关性。结果:经统计学分析,EZH2强表达与患儿肿瘤高分期(X2=6.931,P=0.008)、肿瘤伴有远处转移(X2=5.722,P=0.017)及Ki67强表达(X2=29.827,P=0.000)正相关,与短期治疗效果达VGPR以上呈一定的负相关,P值接近0.05(X2=4.045,P=0.052)。分析EZH2表达与患儿治疗后复发情况提示,EZH2强表达与患儿复发存在一定的相关性,但P值大于0.05(X2=2.699,P=0.100)。而EZH2表达情况与患儿年龄、性别、原发部位及病理类型未见明显相关性(P>0.05)。3.构建稳定过表达和降表达EZH2的NB细胞系,并分析其对NB细胞生物学行为的影响方法:通过构建过表达EZH2和小RNA干扰下调EZH2的慢病毒表达质粒的方法,建立稳定过表达和降表达EZH2的NB细胞系,并利用MTT、Edu增殖实验和Transwell等方法研究EZH2对NB细胞的生长增殖和迁移的影响。结果:(1)成功建立稳定过表达EZH2的NB细胞系SK-N-BE(2)-EZH2-COPGFP和降表达EZH2的NB细胞系SK-N-BE(2)-sh EZH2-74、SK-N-BE(2)-sh EZH2-77,并Western Blotting验证;(2)在SK-N-BE(2)细胞中稳定过表达EZH2后,细胞增殖能力和迁移能力均较对照和空白组增强;(3)在SK-N-BE(2)细胞中利用小RNA干扰下调EZH2表达后,细胞增殖能力和迁移能力均较对照和空白组明显减弱。4.EZH2在NB诱导分化中的作用影响方法:利用反式维甲酸(Retinoic Acid,RA)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromodeoxyuridine,Brdu)诱导NB细胞系分化后,研究EZH2对NB诱导分化的作用影响。结果:(1)经RA诱导刺激后,SK-N-BE(2)细胞出现明显的神经分化,神经轴突丝明显,相互交错,胞体变小,细胞胞体之间聚集,囊泡分泌增多,呈神经节样生长,细胞生长速度明显变慢;(2)经Brdu诱导刺激后,SK-N-BE(2)细胞形态学未发生明显变化,但扁平宽大细胞(类似基质细胞)成份略增多,细胞生长速度未见明显差异;(3)经RA刺激后,EZH2、CD133和Vimentin蛋白均明显减少,而Brdu诱导后EZH2和Vimentin蛋白表达增多,而CD133蛋白变化不明显。结论:1.EZH2在高分期、伴有远处转移的NB患儿组织中高表达,与Ki-67表达成显著正相关性,并与患儿预后负相关,提示EZH2是NB的一个促癌因素;2.细胞功能实验显示,EZH2促进SK-N-BE(2)细胞的生长增殖和迁移;3.RA和Brdu诱导刺激SK-N-BE(2)后,EZH2蛋白表达发生明显变化,提示其可能参与NB的肿瘤干细胞维持和诱导分化。