论文部分内容阅读
背景狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引发的一种高度致死的急性人兽共患传染病。我国95%以上的狂犬病都是由犬引起的,其次是猫。该病目前尚无有效治疗方式,病死率接近100%。我国计划在2030年消除由犬传播的人类狂犬病。动物接种疫苗是预防狂犬病最有效的措施,但是传统的狂犬病疫苗成本较高,这阻碍了动物强制性免疫的实施。因此,急需开发一种廉价、安全、有效的新型狂犬疫苗。SFTS(Severe fever with thrombocytopenia syndrome)是 2011 年发现的由SFTSV(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus)引起的一种人兽共患的新发病毒传染性疾病。该病具有起病急、病死率高、分布广泛等特性。SFTSV动物感染谱广,犬、猫、牛、羊等多种家养动物及野生动物都是SFTSV的主要宿主。特别是犬、猫等伴侣动物,与人类密切接触,传播风险高,是造成人类感染的主要传染源,近年来受到密切关注。但是目前还没有批准的SFTSV的疫苗及药物,因此,急需开发SFTSV疫苗以有效控制SFTS的传播。综上所述,狂犬病和SFTS都是严重的人兽共患病,且犬、猫是RABV和SFTSV重要的共同传播宿主。在我国,家养动物需强制性免疫狂犬疫苗,因此迫切需要研制一种能够同时预防RABV和SFTSV的安全、廉价、高效的二联疫苗,切断动物传播途径,保护人与动物的免遭感染。研究表明,腺病毒载体疫苗能够在体内诱导产生较强的体液和细胞免疫,安全性高,应用广泛。本研究以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,插入RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白,构建重组人5型腺病毒Ad5-G-Gn。通过体外细胞实验和动物实验分析重组病毒Ad5-G-Gn的生物学特性、免疫原性及保护性。目的1.将RABVG蛋白基因和SFTSVGn蛋白基因插入到Ad5载体中,构建共表达RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白的重组人5型腺病毒Ad5-G-Gn。2.通过体外细胞实验分析Ad5-G-Gn的生物学特性;动物实验分析其免疫原性、中和抗体效价和保护率。方法1.重组病毒Ad5-G-Gn的构建及鉴定:将目的基因RABV G和SFTSV Gn通过P2A基因连接,重组至人5型腺病毒,构建重组病毒Ad5-G-Gn。与对照病毒Ad5-GFP同时接种293T细胞,通过免疫荧光实验和Western blot实验分析RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白的表达情况。2.小鼠免疫及Ad5-G-Gn毒力鉴定:6-8周龄雄性C57/BL6小鼠随机分成3组,分别免疫Ad5-G-Gn,Ad5-GFP和DMEM,免疫后21天内,连续监测小鼠的饮食情况、精神状况、体重变化等。3.Ad5-G-Gn诱导特异性中和抗体的能力检测:免疫C57/BL6小鼠后第2、4、8周采集小鼠血清,分别用荧光抗体病毒中和实验(Fluorescent antibody virus neutralization,FAVN)和荧光灶减少中和实验(Fluorescent reduction neutralization test,FRNT)检测RABV和SFTSV的中和抗体效价。4.Ad5-G-Gn保护效力检测:免疫C57/BL6小鼠4周后,后肢肌内注射RABV或SFTSV。观察感染RABV后小鼠的临床症状,来检测Ad5-G-Gn对RABV致死性攻击的保护作用;并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测感染SFTSV后小鼠脾脏内的病毒载量,来检测Ad5-G-Gn清除SFTSV的速率。5.Ad5-G-Gn诱导小鼠淋巴结募集/激活DCs和B细胞的能力检测:免疫BALB/c小鼠后第3、6、9天,利用流式细胞实验验证Ad5-G-Gn诱导小鼠淋巴结募集/激活DCs(CD11c+CD86,+CD11c+MHCI+,CD11c+MHCII+)、B(CD19+CD40+)细胞的能力。6.Ad5-G-Gn诱导小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4特异性T细胞的能力检测:免疫BALB/c小鼠后第4周,利用酶联免疫斑点实验(ELISpot)分析在RABV和SFTSV特异性刺激下,Ad5-G-Gn诱导小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4特异性T细胞的能力。7.Ad5-G-Gn诱导小鼠产生特异性抗体的能力检测:免疫C57/BL6小鼠后第2、4、8周采集小鼠血清,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)实验分析在RABV和SFTSV特异性刺激下,Ad5-G-Gn诱导小鼠产生特异性Ig/IgG2c/IgG1的能力。结果1.通过免疫荧光实验和Western blot实验分析,RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白在重组病毒Ad5-G-Gn感染的293T细胞中表达且大小均与预期一致。2.免疫后21天观察期内,与空白组和Ad5-GFP对照组小鼠进行比较,Ad5-G-Gn实验组小鼠体重无统计学差异,三组小鼠体重都呈现上升趋势,且生长状态良好,无异常状况出现。3.FAVN和FRNT实验结果证明,Ad5-G-Gn能诱导小鼠产生高效价的RABV和SFTSV中和抗体,免疫4周后平均抗体水平可分别达到27.72 IU/ml和1:102。4.RABV感染实验结果显示,Ad5-G-Gn能100%保护小鼠免受感染,而空白组和Ad5-GFP组均100%发病。SFTSV感染实验结果显示,Ad5-G-Gn组小鼠脾脏病毒载量显著低于空白组和Ad5-GFP组。5.流式细胞实验结果显示,与空白组和Ad5-GFP组相比,Ad5-G-Gn可在小鼠体内募集和/或激活更多的DCs、B细胞。6.ELISpot实验结果显示,免疫4周后,Ad5-G-Gn组小鼠脾细胞产生的特异性斑点形成细胞(SFCs)数目明显多于空白组和Ad5-GFP组。7.ELISA实验结果显示,Ad5-G-Gn可诱导小鼠产生较高的特异性Ig效价,在免疫4周后,小鼠产生较强的Th1型免疫反应。结论1.成功构建了共表达RABV G蛋白和SFTSV Gn蛋白的重组人5型腺病毒Ad5-G-Gn。2.Ad5-G-Gn毒力小,免疫原性好,可激发小鼠强烈的体液免疫和细胞免疫,对RABV和SFTSV感染具有较强的保护作用,表明Ad5-G-Gn可作为RABV和SFTSV的二联候选疫苗。