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第一部分2例先天性角化不良患者的临床、免疫学特征及基因突变分析
背景：先天性角化不良(Dyskeratosis congenita，DC)是由于端粒维持缺陷而引起的一种综合征。与DC相关的免疫缺陷可导致过早死亡，但DC患者，尤其是年轻患者的免疫学特征和分子特征尚未被详细描述。
目的：分析我院就诊的2例先天性角化不良患者的临床资料，端粒相对长度、基因突变位点信息以及详细的免疫学表型，旨在为DC患者早期诊断、免疫评估以及针对性的免疫治疗提供信息。
方法：以2019年1月到2019年10月期间在重庆医科大学附属儿童医院就诊的2例来自不相关家庭的先天性角化不良患者为研究对象。总结并分析2例DC患者的临床资料；通过全外显子测序及Sanger测序分析基因突变位点，并利用Swiss-PdbViewer预测蛋白结构的变化以分析突变位点的致病性；采用QPCR法测定相对端粒长度；运用流式细胞术综合分析淋巴细胞亚群及CD57表达情况。
结果：两例患者均表现出典型的DC特征，无严重感染。此外，患者1(P1)由于小脑发育不全被诊断为Hoyeraal-Hreidarsson综合征。基因测序显示P1的PARN基因发生复合杂合突变(c.204G>T和c.178-245del)，P2则在DKC1基因发生半合突变(c.1051A>G)。淋巴细胞亚群分析显示两例患者均有B和NK细胞减少，CD4:CD8比值倒置，初始CD4和CD8细胞的减少，CD21lowB细胞显著增多。另外，两例患者都有不同程度的辅助性T细胞(Th)、调节性T细胞(Treg)、滤泡调节性T细胞(Tfr)和滤泡辅助性T细胞(Tfh)数量异常。在两例患者中均发现端粒长度较短、CD57表达增加、CD8效应记忆T细胞以及CD45RA(TEMRA)表达增加。
结论：在进展为严重疾病之前，DC患者在儿童时期会出现独特的免疫异常，CD8T细胞衰老和端粒缩短可能是其标志。
第二部分：WASp通过CD19及ITIM途径促进BCR-FCγRIIB-pSHIP介导的B细胞负调控机制研究
背景：Wiskott-Aldrich综合征(WAS，Wiskott-Aldrich syndrome)，即湿疹、血小板减少伴免疫缺陷综合征。除典型的临床表现外，现研究发现WAS病人高发自身免疫性疾病(42%-70%)，而具体发生机制尚不清楚。近期研究阐明BCR-FcγRIIB通路通过负调控B细胞信号活化而保持免疫平衡，我们的前期研究发现WASp缺陷引起BCR-FcγRIIB-pSHIP介导的B细胞信号的负调控受损，其受损程度高于活化信号，使机体处于一个相对强活化的状态而导致自身免疫。
目的：本研究拟以WAS病人及WAS-ko小鼠为研究对象，进一步探究WASp缺陷导致这一负调控受损的机制，为WAS患者自身免疫精准干预治疗提供靶点。
方法：运用流式细胞术、TIRF(全内反射荧光显微镜)及Western-blot分析BCR-FcγRIIB-pSHIP介导的B细胞信号通路中SHIP上游分子的表达情况。
结果：我们发现与对照组相比，WASp缺陷使与SHIP在ITIM募集、活化直接相关的分子Lyn的磷酸化受损。再者，缺陷虽然不影响静息状态下FcγRIIB的表达，但影响了FcγRIIB的磷酸化。另外，我们还发现CD19作为BCR重要的共受体，参与募集Lyn、Fyn等信号分子，其磷酸化在WASp的缺陷的情况下也是下降的。
结论：结果表明WASp的缺陷影响了CD19、CD32b及Lyn的活化而引起了BCR-FcγRIIB-pSHIP介导的B细胞信号的负调控受损，即WASp通过CD19及ITIM途径促进了BCR-FCγRIIB-pSHIP介导的B细胞负调控。
背景：先天性角化不良(Dyskeratosis congenita，DC)是由于端粒维持缺陷而引起的一种综合征。与DC相关的免疫缺陷可导致过早死亡，但DC患者，尤其是年轻患者的免疫学特征和分子特征尚未被详细描述。
目的：分析我院就诊的2例先天性角化不良患者的临床资料，端粒相对长度、基因突变位点信息以及详细的免疫学表型，旨在为DC患者早期诊断、免疫评估以及针对性的免疫治疗提供信息。
方法：以2019年1月到2019年10月期间在重庆医科大学附属儿童医院就诊的2例来自不相关家庭的先天性角化不良患者为研究对象。总结并分析2例DC患者的临床资料；通过全外显子测序及Sanger测序分析基因突变位点，并利用Swiss-PdbViewer预测蛋白结构的变化以分析突变位点的致病性；采用QPCR法测定相对端粒长度；运用流式细胞术综合分析淋巴细胞亚群及CD57表达情况。
结果：两例患者均表现出典型的DC特征，无严重感染。此外，患者1(P1)由于小脑发育不全被诊断为Hoyeraal-Hreidarsson综合征。基因测序显示P1的PARN基因发生复合杂合突变(c.204G>T和c.178-245del)，P2则在DKC1基因发生半合突变(c.1051A>G)。淋巴细胞亚群分析显示两例患者均有B和NK细胞减少，CD4:CD8比值倒置，初始CD4和CD8细胞的减少，CD21lowB细胞显著增多。另外，两例患者都有不同程度的辅助性T细胞(Th)、调节性T细胞(Treg)、滤泡调节性T细胞(Tfr)和滤泡辅助性T细胞(Tfh)数量异常。在两例患者中均发现端粒长度较短、CD57表达增加、CD8效应记忆T细胞以及CD45RA(TEMRA)表达增加。
结论：在进展为严重疾病之前，DC患者在儿童时期会出现独特的免疫异常，CD8T细胞衰老和端粒缩短可能是其标志。
第二部分：WASp通过CD19及ITIM途径促进BCR-FCγRIIB-pSHIP介导的B细胞负调控机制研究
背景：Wiskott-Aldrich综合征(WAS，Wiskott-Aldrich syndrome)，即湿疹、血小板减少伴免疫缺陷综合征。除典型的临床表现外，现研究发现WAS病人高发自身免疫性疾病(42%-70%)，而具体发生机制尚不清楚。近期研究阐明BCR-FcγRIIB通路通过负调控B细胞信号活化而保持免疫平衡，我们的前期研究发现WASp缺陷引起BCR-FcγRIIB-pSHIP介导的B细胞信号的负调控受损，其受损程度高于活化信号，使机体处于一个相对强活化的状态而导致自身免疫。
目的：本研究拟以WAS病人及WAS-ko小鼠为研究对象，进一步探究WASp缺陷导致这一负调控受损的机制，为WAS患者自身免疫精准干预治疗提供靶点。
方法：运用流式细胞术、TIRF(全内反射荧光显微镜)及Western-blot分析BCR-FcγRIIB-pSHIP介导的B细胞信号通路中SHIP上游分子的表达情况。
结果：我们发现与对照组相比，WASp缺陷使与SHIP在ITIM募集、活化直接相关的分子Lyn的磷酸化受损。再者，缺陷虽然不影响静息状态下FcγRIIB的表达，但影响了FcγRIIB的磷酸化。另外，我们还发现CD19作为BCR重要的共受体，参与募集Lyn、Fyn等信号分子，其磷酸化在WASp的缺陷的情况下也是下降的。
结论：结果表明WASp的缺陷影响了CD19、CD32b及Lyn的活化而引起了BCR-FcγRIIB-pSHIP介导的B细胞信号的负调控受损，即WASp通过CD19及ITIM途径促进了BCR-FCγRIIB-pSHIP介导的B细胞负调控。