胶质瘤细胞在TiO2纳米管薄膜表面生物学行为的研究

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大量的研究证实,许多种族的细胞对周围微环境或植入材料在纳米尺度上形貌的变化具有很强的“感知力”,这种识别能力对细胞的迁移、增殖和生长具有极其重要的作用。我们可以利用细胞的这种“感知力”对至今仍令医学界束手无策的脑胶质瘤细胞进行体外培养和体外研究,来进一步认识脑胶质瘤细胞的生物学行径,进而发现不同细胞种群间对纳米效应感知力的差异性,为将来在临床上治疗胶质母细胞瘤提供一定的理论依据。纳米材料的出现为细胞体外培养支架的研究提供了新的选择。新型TiO2纳米管阵列薄膜具有均匀的孔径,良好的生物相容性和光致双亲效应,被认为是理想的生物医用材料。采用电化学阳极氧化法制备TiO2纳米管阵列薄膜,操作简便、成本低,且能通过调节工艺参数获得不同尺度的薄膜。同时通过阳极氧化法制得的薄膜,其纳米管状结构的孔密度较高(>1010个/cm2)。本研究中采用两步阳极氧化技术在纯钛表面获得具有管状结构的TiO2纳米管阵列薄膜,再利用一系列生物学技术处理该薄膜,我们以大鼠胶质瘤细胞系C6细胞为研究对象,探究了细胞在薄膜表面培养时对纳米微环境变化的感知力。  本研究分为三个部分。首先,采用两步电化学阳极氧化法制备TiO2纳米管阵列薄膜,在氧化过程中通过改变氧化电压和氧化时间,制备出具有不同微观形貌的TiO2纳米管阵列薄膜。并通过在空气氛围中煅烧得到具有混晶结构的TiO2纳米管阵列薄膜。其次,在纳米管阵列薄膜表面培养大鼠胶质瘤细胞系C6细胞,采用免疫荧光染色法对接种于不同管径TiO2纳米管阵列薄膜上的C6细胞进行观察;并通过MTT比色法进行不同管径TiO2纳米管阵列对C6细胞增殖情况影响的检测;再利用流式细胞仪对培养在不同管径TiO2纳米管阵列上C6细胞的凋亡情况进行检测。最后,从TiO2纳米管阵列表面培养的C6细胞中提取RNA,根据文献和专用设计软件设计并进行相应的mRNA引物合成;取细胞RNA进行逆转录和聚合酶链式反应;随后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,并将电泳结果放在紫外线透射反射分析仪上观察,然后通过凝胶成像系统测算电泳条带的光密度值。  本研究表明:纳米管的管径尺寸随着电压的增加而变大;延长氧化时间可以增加纳米管的长度,但这样会降低F-的扩散速率,从而使氧化速率降低,因此在薄膜中会出现沟壑形貌;TiO2纳米管阵列薄膜样品经高温退火处理后,变为锐钛矿和金红石的混晶结构;通过细胞免疫化学分析及MTT实验证明,C6细胞在TiO2纳米管阵列表面的生物学行为具有明显的尺寸依赖性,TiO2纳米管阵列在管径范围介于10-30nm之间时有利于C6细胞的生长;细胞在15nm-TNT的薄膜表面具有最佳活性,当管径超过50nm时,TiO2纳米管阵列能够明显地诱导细胞凋亡;C6胶质瘤细胞在不同样品表面培养24小时后多种炎性介质基因表达水平有差异,且不同炎性介质基因表达水平趋势不同;总之,15nm的管径间距适合作为整合蛋白回馈细胞核的信号通路,并能够最大程度地刺激整合蛋白的活性,从而影响细胞行为,而大于50nm的管径间距会明显地限制细胞的附着和迁移,最终导致细胞凋亡。
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