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近年来偶氮染料的生物降解受到广泛关注,国内外学者陆续分离并考察了众多可脱色偶氮染料的微生物,纯化并研究了多种具有偶氮还原酶活性的蛋白质,但对于偶氮还原酶的结构与功能缺乏深入认识。本论文对细菌脱色偶氮染料的能力,细菌FMN依赖型偶氮还原酶的结构模型与功能等展开研究。考察沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris AS1.2352细胞及其细胞提取物脱色偶氮染料的能力。对于生长过程中的R.palustris AS1.2352,在静置缺氧条件下,可在17 h内脱色80%以上活性艳红X-3B(50 mg L-1)。细菌在30-35℃和pH 6-9具有较高脱色能力。脱色速率与染料初始浓度间可用米门方程描述,Vmax和Km分别为65 mg gcell-1h-1和978 mg L-1。其细胞提取物具有偶氮还原酶活性,脱色速率远高于未破碎的细菌细胞。对比考察两株光合细菌Rhodobacter sphaeroides AS1.1737,R.palustris AS1.2352和基因工程菌Escherichia coli YB静止期早期细胞脱色含磺酸取代基的偶氮染料的能力。光合细菌表现出较基因工程菌更强的脱色能力。R.sphaeroides AS1.1737,R.palustrisAS1.2352和E.coli YB的Vmax/Km值分别为0.2,0.15和0.06 Lg cell-1h-1。两株光合细菌具有较好的脱色混合染料的能力,E.coli YB脱色混合染料的效果不佳。利用同源建模方法建立了R.sphaeroides AS1.1737的偶氮还原酶AZR的结构模型。AZR的单体具有类似黄素氧化还原蛋白的α/β型结构,五个相互平行的β-折叠位于分子中央形成一个平面,五个α-螺旋分别位于平面两侧,一侧两个,另一侧三个;分子中结合的FMN辅基可能作为氧化还原反应中电子传递的中介。尽管依序列可将FMN依赖型偶氮还原酶归为两个家族,但它们的单体都具有类似黄素氧化还原蛋白的三级结构。利用NAD（P）H提供电子,AZR可还原多种硝基化合物。以硝基呋喃为底物,AZR硝基还原酶的最适pH=7,最适温度为50℃。NADPH为更适合的辅酶,反应遵循双底物乒乓动力学机理。比较AZR对2,4,6-三硝基甲苯（TNT）、2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT）、2,6-二硝基甲苯（2,6-DNT）等几种多硝基取代甲苯的还原发现,TNT为最适底物;2,4-DNT比2,6-DNT更适合降解。经HPLC/MS检测,TNT的还原产物可能为羟胺二硝基甲苯。AZR能遵循双底物乒乓动力学机理还原外加FMN。NADPH和FMN的米氏常数分别为0.5和14.2 mM,Vmax为172.4μmol mg protein-1min-1;外加FMN抑制AZR的偶氮还原酶和硝基还原酶活性,是NADPH、甲基红和硝基呋喃的竞争性抑制剂,抑制常数K1分别为1.7、2.3和6.4μM。AZR具有广泛的底物范围,不但可以还原偶氮化合物、硝基化合物和FMN等有机物,还可以还原铁氰化钾和重铬酸钾等无机底物,是一种新的硝基/FMN还原酶家族的成员。在序列对齐分析和结构模型分析的基础上,选择AZR分子中FMN辅基附近两个环状结构中的Tyr74、His75和Lys109等氨基酸位点,利用多次PCR的方法进行了K109A,K109H,Y74W和H75N等定点突变研究。利用E.coli异源表达并纯化几种突变型AZR。对比考察野生型与突变型AZR的活性。以酸性红B为底物,野生型AZR的最适pH为7-8,K109H和H75N的最适pH=6,而K109A和Y74W的最适pH=9。突变的引入可能改变了AZR分子表面的电荷情况,从而改变了其最适pH。与野生型AZR相比,几种突变型AZR的酶活都出现下降,表明Y74、H75和K109对酶活有重要影响。分析底物结合常数表明,Y74W和H75N突变对NADPH的结合无影响,而只影响AZR对甲基红和硝基呋喃的结合;H75N突变后AZR完全丧失硝基还原酶活性。第109位氨基酸荷正电对甲基红的结合有重要影响,而对硝基呋喃的结合无影响;K109H对NADPH的结合并非保守突变,其结合不仅需要该处荷正电,可能还与空间结构有关。K109可能只参与对NADPH的2’-磷酸基团的结合,而对NADH的结合无影响。自然界中天然存在的偶氮类和硝基类芳香化合物并不常见,因此还原酶AZR可能具有其他功能。醌类化合物广泛存在于自然界和各种生物体的代谢过程中。AZR与来自不同域的醌还原酶的氨基酸序列中都较为保守地存在一段40-50个氨基酸构成的参与结合底物与辅酶的序列。AZR与醌还原酶NQO1的单体具有类似的α/β型结构（rmsd=9.5 A,467 atoms）和黄素辅基结合方式。AZR具有醌还原酶活性,遵循乒乓机理,可还原甲萘醌、2-羟基-1,4-萘醌（LQ）、葸醌-2-磺酸和葸醌-2,6-二磺酸等萘醌和葸醌化合物,甲萘醌为最适底物,而对1,4-苯醌无活性。与偶氮和硝基化合物相比,醌类化合物为AZR更适合的底物。双香豆素抑制AZR的醌还原酶活性,为NADPH的竞争性抑制剂,抑制常数K1=87.6μM。胞内过量表达的醌还原酶AZR提高了E.coli YB对氧化应激的耐受。在H2O2、甲萘醌、百草枯等应激源存在条件下和经热休克处理后,E.coil YB的存活率都高于对照株E.coli JM109。氧化还原介体LQ的加入可提升E.coli JM109和E.coliYB培养物脱色偶氮染料的能力。E.coil YB的介导脱色能力较E.coli JM109更为突出:在0.2 mM LQ存在下,E.coli YB 2 h内可脱色75%的苋菜红（1 mM）,为目前已报道的最佳的细菌脱色表现,体现了基因工程菌降解能力的优势,为胞内异源表达的还原酶的应用提供了新的思路。本研究深化了对FMN依赖型偶氮还原酶的结构与功能的认识,为AZR等还原酶的应用奠定基础。