针对美白化妆品的安全性、功效性需求趋势,目前支撑美白产品研发的技术体系比较散弱。本课题意在建立一套相对完整的技术体系用于美白产品新资源的开发和利用。该体系将围绕体外化学功能评价、细胞模型评价和动物模型评价三个层次对天然美白剂展开研究。第一,以抗氧化能力和酪氨酸酶活性抑制能力作为体外化学功能水平评价美白剂的重要指标,通过这两项指标的检测可以对物质的美白功效进行初步评估。检测物质对羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基等的清除能力,可有效评估物质的抗氧化能力;检测物质对酪氨酸酶活性的影响从而判断所选物质抑制酪氨酸酶活性能力。第二,通过细胞模型评价物质的美白功效。该评价体系包括:1.基于美白功效评价的B16细胞模型的建立。研究发现B16细胞在体外培养时其黑色素合成受培养基成份影响极大,研究结果甚至为培养基的选择所决定。基于此,本课题首先通过研究不同培养基对细胞生物学特性及黑色素表达能力的影响,发现B16细胞在RPMI-1640(Gibco,31800)和DMEM(Gibco,12800)两种培养基中生长状态良好,在RPMI-1640培养基中基本不合成黑色素,但在DMEM培养基中可大量合成黑色素。通过相关分子作用机制研究进行分析,结果发现:与RPMI-1640培养基相比,DMEM培养基所培养的细胞其酪氨酸酶(Tyrosinase)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP 1)和酪氨酸酶相关蛋白2(TRP 2)等三种黑色素合成相关蛋白的mRNA的转录水平基本没有差异,而蛋白质表达水平均明显提高,总蛋白质组也更加多样。因此,可利用DMEM培养基培养B16细胞,研究物质抑制黑色素生成的能力。2.利用比基尼链霉菌具有产黑色素的能力,辅助美白剂功效评价。第三,建立斑马鱼美白功效评价模型。利用斑马鱼体外受精十几小时后胚胎黑色素合成体系开始启动,胚胎透明容易观察黑色素生成等特点;同时斑马鱼具有与人类基因高同源性、易于培养、样本量大、实验周期短等优点,利用斑马鱼研究美白具有极大的优势。在预先完成细胞毒性测试的前提下,利用斑马鱼进行研究,能够更符合动物物伦理要求。利用以上初步建立的美白剂筛选和评价技术,本课题对10种植物提取物进行逐级分析和评价。结果发现:1.铁皮石斛鲜条和金线莲水提物具有明显抗氧化和抑制酪氨酸酶活性作用,并且具有剂量效应。2.铁皮石斛鲜条、铁皮石斛原球茎和细梗香草水提物等对B16细胞和比基尼链霉菌的黑色素生成均具有明显抑制作用,金线莲水提物可明显地抑制B16细胞黑色素合成作用,但对比基尼链霉菌作用不明显。利用B16细胞研究金线莲和铁皮石斛对细胞毒性、细胞周期和黑色素生成等的影响,发现浓度为200μg/ml的两种测试物均不影响细胞的正常生长,均可明显抑制黑色素生成。3.铁皮石斛鲜条、铁皮石斛原球茎和金线莲水提物等对斑马鱼黑色素生成均具有较好抑制作用,而细梗香草几乎没有抑制效果。本课题通过该筛选和评价技术,初步得到了金线莲、铁皮石斛鲜条、铁皮石斛原球茎等3种具有潜在美白剂开发价值的植物。此外,本课题还利用Western blot、半定量RT-PCR和双向电泳等实验手段,通过考查Tyrosinase、TRP 1和TRP 2等三种黑色素合成相关蛋白的表达水平,探究铁皮石斛多糖美白作用机理。结果表明:铁皮石斛多糖对Tyrosinase的mRNA转录水平影响不大,而TRP 1与TRP 2的mRNA转录水平有所下降;铁皮石斛多糖能明显降低Tyrosinase和TRP 2的蛋白表达水平,而TRP 1的蛋白表达水平有所提高;这三种蛋白质的mRNA转录水平与相对应的蛋白质表达水平不总是一致,与前人黑色素合成相关研究结果相似。结果初步判断该多糖可通过降低Tyrosinase与TRP 2蛋白表达水平阻断细胞黑色素生成途径,降低黑色素生成量。另外,通过双向电泳分析铁皮石斛多糖对细胞总蛋白质组的影响,发现6个差异蛋白质点,其是否与黑色素合成作用相关后续再进一步研究。